NEPTUNEは、胚発生7.5日目からマウス胚神経系のターゲティングと遺伝子操作を可能にし、数日でノックダウンまたは系統追跡モデルの生成を可能にします。このプロトコルは、適応性があり、柔軟性があり、高速です。shRNA、cdRNA、またはバーコード化されたウイルスライブラリを提供して、数か月または数年ではなく数日でさまざまな質問に対処できます。
私たちは、海王星が神経科学の洞察を提供することを期待していますが、他の臓器系にも適応することができます。羊膜腔を特定することは非常に難しい場合があるため、時間をかけて超音波画像を見て、教科書やその他の解剖学リソースを手元に用意してください。針の装填を開始するには、ガラス針を金属製のプランジャーにスライドさせ、コレットを取り付けたまま少し緩めます。
次に、キャピラリーニードルを金属プランジャーと一緒にフロントガスケットに通して、スペーサーに到達するまで押します。空を押してプランジャーを針に押し込み、針先からオイルを排出します。次に、塗りつぶしを押して気泡を作成し、オイルと溶液を分割します。
最後に、針を下げ、先端を溶液に浸し、もう一度[塗りつぶし]を押して針をロードします。麻酔をかけた羊膜が理想の大きさの雌マウスを加熱台に固定した後、角膜の乾燥を防ぐためにアイジェルを両目に塗布し、鎮痛剤を皮下注射します。次に、1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのクロルヘキシジン溶液を浸した布で拭いて下腹部を滅菌し、皮膚を乾燥させます。
次に、外科用ハサミを使用して、下腹部の1.5〜2センチメートルの垂直正中線皮膚切開を行います。次に、皮膚をやさしく持ち上げ、切開点の周りの約1センチの下にある筋肉層から解放して、手術後の縫合を容易にします。次に、筋肉層に1センチの垂直正中線切開を行います。
1対の鉗子を使用して、皮膚と筋肉層の片側を持ち上げ、別の対で子宮角を探します。次に、鉗子を使用して、胚の間に組織を保持し、腹部から両方の子宮角を慎重に引き出します。両側の卵巣から子宮頸部まで、または子宮頸部から卵巣まで、胚を数えて番号を付けます。
次に、湿った綿棒で、注射する最初の3つを除くすべての胚を腹腔内にそっと押し戻します。次に、市販の改良ペトリ皿の丸い中央開口部に接着された弾性膜にPBSを一滴置き、胚のすぐ上に保持します。閉じた鉗子を弾性の切開部に挿入し、次に鉗子を放して弾性切開部を開き、液体を胚に落とします。
鉗子を使用して、3つの胚に対応する子宮の部分を弾性を通して引っ張り、マウスの腹部にペトリ皿を静かにとめます。4本の粘土の足を使用して、ペトリ皿を腹部の上に固定して固定し、マウスへの圧力を軽減し、マウスの呼吸と心拍に対するイメージングの感度を低下させます。次に、鉗子と湿った綿棒を使用して、子宮と弾性体を調整して、弾性体がマウスの皮膚の周りに密閉されるようにし、PBSの漏れを防ぎます。
次に、子宮を固定するために、モデリング粘土シリンダーを胚または子宮の右側に押し下げ、胚と子宮が完全にPBSで覆われるまでPBSをペトリ皿に追加します。注射の記録を容易にするために、超音波プローブをPBSに浸し、最初の胚が超音波プローブと整列するようにマウスまたは手術台を調整します。3つの胚すべてをスキャンし、羊膜腔を検査します。
次に、超音波装置を使用して、羊膜腔の直径を測定し、適切な注入量を決定します。注入コントローラーを使用して、決定された注入量と射出速度を、毎秒23ナノリットルの射出速度で遅く設定します。レールシステムの主輪を使用して針をPBSに下げた後、液体が針の先端に到達するまでナノインジェクターコントローラーのEmptyを押します。
次に、針をPBSから持ち上げてInjectを押して、おおよその目的の量の滴が排出されることを確認します。針を再びPBSに下げ、マイクロマニピュレーターのYプレーンホイールでナノインジェクターを動かして、針を超音波プローブと胚に合わせます。注入角度ホイールで針の角度を調整して、子宮壁に対してほぼ垂直な注入角度を確保します。
次に、マイクロマニピュレーターの注入ホイールを使用して、針を羊膜腔に1回の動きで挿入します。針先が超音波画像から消えた場合は、プローブを前後に動かして針の焦点を元に戻します。次に、Injectを適切な回数押して、目的のボリュームを注入します。
必要な量を注入した後、5〜10秒待ってから、針を1回の穏やかな動きで引っ込めます。ステージを次の胚に移動し、示されているように他の2つの胚に対して注射を繰り返します。次に、マイクロマニピュレーターを使用して超音波プローブと針をPBSから持ち上げ、損傷や怪我を避けるために針をオペレーターから遠ざけます。
鉗子を使用して、1番目と2番目の胚をゴムを通して静かに押して腹部に戻します。次に、3番目の胚に隣接する組織をそっとつかみ、子宮を弾性切開の上端に向かって引っ張ります。4番目から6番目の胚を鉗子でそっと引き上げ、3番目の胚が腹部に再び入るようにします。
最適な羊膜腔を持つすべての胚を注入した後、胚と子宮をマウスの腹部にそっと押し戻します。神経板の形質導入が成功すると、脳や皮膚などの他の外胚葉由来組織に蛍光レポーターが強く発現する胚が得られます。過度に大量の注射をすると、脳症などの神経管欠損が生じる可能性があります。
胚7.5日目に注射が成功すると、脈絡叢を含む前脳から後脳への均一な形質導入がもたらされます。低力価の注射は単一細胞クローンの形質導入をもたらし、高力価ウイルスは脳全体のほぼ100%を形質導入します。胚13.5日目までの冠状切片は、眼、水晶体、角膜、間葉の神経組織の高度で均一な形質導入を示しました。
胚9.5日目に注射した後、唾液腺と管は口腔上皮から胚11.5日目頃に発生します。舌の舌上皮はよく形質導入されていますが、下にある間葉系は陰性です。さらに、舌上皮内の陽性クラスターは陰性部分によって分離されており、乳頭表面の形質導入を示唆している。
胚7.5日目の注射は、胚13.5日目に舌間葉の広範な形質導入をもたらし、早期注射が神経堤細胞を標的とし、舌の間葉に寄与することを示唆している。レンチウイルス注射はまた、中枢神経系および末梢神経系の広範な標的化をもたらし、脊髄ならびに後根神経節のニューロンおよび前駆細胞の両方を形質導入する。十分な準備が不可欠です。
漏れがなく、胚がしっかりと固定されていることを確認して、ラット腔への注射に完全に集中できるようにします。海王星の後、脳の免疫蛍光分析、単一細胞RNAシーケンシング、または行動分析のために注入された胚を産むことを可能にするなど、さまざまな方法で分析を行うことができます。
