我々 は最初の教材 SMK 脳解剖技術 Changhui 朴とたラン Vrailas モーティマーを感謝したいです。私たちも批判的に、原稿を読み取るためケン モーベリの実習グループ、特にクリス ラウンドのメンバーに感謝します。Fas2 を認識する抗体 (1 4) chaoptin (24B10) が銀行ハイブリドーマ発達研究から得られました。シーモア ・ ベンザー、南司・ コリー24,60,61抗体 24B10、DSHB に預けて、コーリー ・ グッドマン22,23,56抗体 1 4、DSHB に預けています。はえの在庫は、ブルーミントンのストック センターから得られました。図 4A に脳をイメージするオハイオ州の農業研究および開発センター (OARDC) MCIC イメージング センター共焦点顕微鏡の使用のために感謝したい、B. SMK は発育からの助成金によってサポートされる (1 R15 HD084241 01A1)。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

上記郭清と可視化の方法はさまざまな免疫染色で使用することができ、ライブ イメージング アプリケーション。我々 は一般的な免疫染色プロトコルの概要を示しているし、個々 のきのこ体ニューロンの軸索形態を視覚化するために MARCM を使用できます 1 つの方法を強調しています。さらに、これらの一般的な手順は固定で他の頭脳領域を画像にも使用できます。 または新たに切り裂かれた大人脳48,65。ライブ イメージングは、例えば模倣66、やレポーター遺伝子エンハンサー トラップの発現パターンを解析するときより効率的なアプローチにあります。防ぐために未固定組織で GFP のライブ イメージ投射の間の細胞死からの人工物をキャプチャするには、脳必要がありますリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) または HL3 メディア48x 1 に解剖、PBS (または HL3) x 1 の橋のスライドのマウントし、未満 15 20 分ケアのイメージそれは GFP 蛍光の可視化と干渉できるので解剖脳イメージング前からできるだけ多くの気管を削除するも撮影する必要があります。
きのこ体と光受容ニューロンの形態を評価するための染色条件では比較的老舗24,61,67, これらの細胞への関心の特定の蛋白質の局在化種類は、広範なトラブルシューティングと最適化に必要があります。特に、抗体希釈、ブロック バッファー成分濃度、固定などいくつかの重要なステップは、最も再現性のある、信頼性の高い結果を生成する最適化必要があります。まず、一次抗体の最適濃度を決定する必要があります。市販抗体はしばしば推奨希釈を持って (とその濃度を使用して、まず、多くの場合最初)、これらの値はほとんど経験的に決定ショウジョウバエのティッシュの。したがって、テストは上と下の開始提案を多くの場合で、製造元の範囲がより特定の染色による一次抗体希釈液のシリーズ。一次抗体希釈精度を染色に大きな影響を持つことができ、的確に判断する必要があります時間の脳は一次抗体を含む培養しながらソリューションすることができます全体の結果にはほとんど影響によって大きく変動。たとえば、我々 は 4 ° C で 3 つ、または 4 日間、2 つの脳 Fas2 抗体一次抗体とインキュベート解剖と同様の結果を観察しています。少なくとも 2 泊をお勧めしますがまた一次抗体溶液中の脳を一晩インキュベートし、再現性のある染色を取得しました。脳組織へ二次抗体の制限非特異的結合が重要なは、脳に部屋の温度 (または 4 ° C で 1 泊) 3 h に二次抗体の孵化の時間の量を制限できます。
第二に、不要なバック グラウンド信号を除去するために追加「ブロッキング」試薬を使用する必要があります。オプションがあります 1-10% ウシ血清アルブミン (BSA) を追加するブロックやプライマリ/セカンダリ抗体ソリューションまたはショウジョウバエの胚 (を参照してください 4 ° C で一晩一次抗体の前吸着 〜 10% に NGS の濃度を増加させる68、セクション 2.9、および参照手順 3)。
深遠な違い、洗浄、抗体培養手順 (PLP と PEM、材料表に記載) など他のバッファーでティッシュの固定可能性があります一方、我々 はすべて固定用推奨バッファーとして PTN を使用して上記プロトコルを書かれている、信号の強さ。たとえば、以前の調査は示したサイクリン E は組織が、PBS で希釈した伝統的な 4% パラホルムアルデヒドで固定するとき、幼虫成虫ディスクで検出可能ですが、組織は PLP バッファー (ケン モーベリ、個人で修正されるときがはっきりと見える通信、および参照69)。バッファーの変更に加えて、コンポーネント、ティッシュの固定、蛍光にも大きく影響するため、温度、時間を変更することは染色および必要な場合経験的決定ことができます。一般に、固定時間細胞成分の十分な架橋を許可するのに十分な長さでありながら全体として細胞の形態の長期的な保守限定に架橋し蛋白質エピトープの「埋め」を防ぐために十分。ですから、当初新たに買収した一次抗体の染色条件を最適化するとき通常約 20 分固定時間制限より冷たい温度で組織を修正することはしばしば。
第一次および二次抗体の特異性だけでなく、観察された表現型の遺伝子/遺伝的背景の影響を調査するため, 蛍光抗体法実験のいくつかのコントロールが含まれます。具体的に使用されている一次抗体が興味の蛋白質を認識するかどうかを確認、このタンパク質やタンパク質を過剰発現組織に欠けているハエから組織をコントロールとして含まれている必要があります。一次抗体がハエの脳に他のエピトープを認識するかどうかを決定するため余分な精製抗原タンパク質添加を含めることもできます。最後に、任意の蛍光信号の一次抗体を省略すると、現在は選択した二次抗体による非特異的結合のレベルを表します。
遺伝的背景の貢献や染色強度または細胞の遺伝子の存在を評価するためにいくつかの重要なコントロールが含めます。たとえば、図 5の MARCM 実験で使用されるハエを含む複数の遺伝子 (hsFLP、UAS CD8 GFP、FRT82B、浴槽 &#62;、GAL80 と OK107 GAL4)、きのこ体の形態に及ぼす影響を個別に分析します。ハエの非常に最低、きのこボディ形態で OK107 GAL4 と UAS CD8 GFP の両方を含むを分析する必要があります。ヒート ショックの影響を評価する必要があります、分析によってきのこ体における Flp リコンビナーゼ生産ハエ hsFLP と FRT82B の両方を含みます。MARCM は、特定のタンパク質が自律的軸索ガイダンスを制御するかどうかの重要な洞察を提供できますが、この結論を正確に行うために必要なコントロールの数は、この技法のマイナーな制限をすることができます。それほど複雑な実験では、類似のコントロールも適用されます。例えば、 GAL4/UASシステムがすべてのニューロンの興味の蛋白質のノックダウン式に RNAi 遺伝子との組み合わせで使用されている実験を取る。この実験では、少なくとも 2 つの遺伝子がある: elav-GAL4とUAS RNAi遺伝子などのパン神経 GAL4 ドライバー。ハエが同じ場で両方の遺伝子を抱く実験条件に加えて、単独でこれらの遺伝子の各を含むハエのきのこ体神経細胞の形態を調べる必要があります。
最後に、きのこ体神経に興味の蛋白質を表現するかどうか判断する必要がある通常共同染色脳に Fas2 抗体また、 GAL4/UASシステムを使用し、興味の蛋白質を認識する抗体と組み合わせて使用される蛍光タンパク質 GFP、RFP、または膜が CD8 GFP をバインドされているようを表すこともできます。Fas2 だけきのこ体の α と β の葉を形成した軸索が認識、GAL4 駆動、膜結合型 CD8 GFP の使用が以来きのこ体神経をマーキングする場合に役立ちます。
軸索ガイダンスの欠陥は、しばしば 100% の浸透と同じ遺伝子型のも脳は、いくつかの変動を示すことがあります。したがって、きのこ体や光受容体経路で生成される欠陥の突然変異体の対立遺伝子と新しく分析、異なる対立遺伝子とアプローチの組み合わせを利用する必要があります。文献の研究のほとんどはタンパク質が軸索ガイダンスを制御する細胞自律的役割を果たしているかどうかを調査するいくつかの異なるアプローチを使用: 私) (できれば異なるニューを使用して null のホモのハエで欠陥経路の解析ll の対立遺伝子)、ii) (RNAi) によって通常のニューロンにだけ興味の蛋白質に欠けているハエの欠陥経路の解析 iii) 草分け欠陥と iv の MARCM 解析) 遺伝子のホモ null のニューロンの再発現実験を救出ハエ。理想的には、遺伝子ごとのいくつかのダース脳神経細胞形態の欠陥を分析します。
プロトコルは固定ティッシュ内の蛋白質の蛍光像定位に主に焦点をここで説明するがこの手法のいくつかの将来のアプリケーションは、画像ライブ脳組織に開発されています。25 ° C で数日間、その後培養することができます脳は、(通常の細胞培養媒体) は解剖して、一度彼らこれら体外培養方法は、さまざまな傷害70,71, 細胞軸索再生を促進するタンパク質の活性などの生物学的プロセスを調査するために開発されています。シグナル伝達ダイナミクス72と神経の開発73。

ショウジョウバエ神経系は人間および齧歯動物のそれより小さいが、その複雑さは、脊椎動物の対応を理解するための強力な親しみやすいモデルを提供します。多くのケースでは、ハエと脊椎動物のゲノムは神経系発達のメカニズムを定める非常によく似たタンパク質をエンコードします。実際には、遺伝子の多くは脊椎動物の神経の開発のため含め、ハエのオルソログ遺伝子関与しているシグナル伝達経路の制御パターン、ニューロン新生、軸索ガイダンス1,2,3、必要な ,4,5。たとえば、ネトリン哺乳類とキイロショウジョウバエ6,7,8の軸索ガイダンスに必要なリガンドであり。ネトリンだった鶏胚脳組織6から分離されたが、その後の研究によって、そのネトリンショウジョウバエ8胚中枢神経系 (CNS) の開発中に保存された役割を果たしているが明らかにしました。他の研究は、保存されたリガンドと受容体のショウジョウバエと脊椎動物の両方9の経路探索に必要な識別するために萌芽期のショウジョウバエ中枢神経系における遺伝子スクリーニングを使用しています。
中枢神経系胚のフライは過去にリガンド、受容体と軸索ガイダンス8,9に必要な細胞内シグナル伝達タンパク質を識別するために広く使用されています、一方の最近の作品の多くで方法を調査します。これらの蛋白質はまた開発の後の段階の間に経路決定を制御します。具体的には、そのコントロールの草分け、シナプス形成、軸索プルーニングおよび神経の他のいくつかの側面きのこ体 (MB) および網膜光受容ニューロンの開発 (図 1) の調査は、メカニズムに洞察力を提供して開発10、11,12,13,14,15,16,17。光受容器ニューロンは、ラミナと呼ばれる大人の脳の領域に飛ぶ網膜を接続し、延髄と脳 (18,19によって再検討されました)、きのこ体神経細胞中に視覚情報を中継するための重大である、一元的にハエの脳に位置し、学習と記憶の20,21に必要な。ケニヨン細胞と呼ばれるきのこの体の本質的なニューロンと光受容器ニューロン シナプス ターゲットを見つけるに進化上保存された拡散性と接触依存性軸索ガイダンス機構を利用します。成虫の表示だけでなく、感光体と MB ニューロンも直接で視覚化すること幼虫と蛹抗体やレポーター遺伝子22,23,24,25。ニューロン発達の異なる時点でのこれらの 2 つのセットを簡単に視覚化する能力は、神経の開発の多くの側面の見事なモデルとしての使用を推進しています。
通常の神経系発達のメカニズムを理解するためのモデルとして使用されているだけでなく最近の研究を示しているハエがさまざまな壊れやすい X シンドローム (FXS)26 を含む人間の病気の正確なモデルとしても利用できます。、知的障害者 (ID)27,28,29,30,31, その他32。たとえば、ZC3H14 の分子機能を勉強する最近人間の知的障害にリンクされて遺伝子我々 モデルを作成飛ぶ Nab230と呼ばれるフライ ZC3H14 相同のヌル対立遺伝子を使用して ID の。ハエ Nab2 を欠けている重度の記憶障害があると人間の患者で観察されるものの概説ポリ a の尾を拡張、または患者由来細胞ライン33,34。重要なは、Nab2 にまた欠けているハエは、その大人のきのこ体34, FMR135FXS 症候群遺伝子に欠けているハエで観察されるものと同様で重篤な脳形態の欠陥を表示します。したがって、ハエは、通常の脳の発達やそれを混乱させる疾患を研究する重要なモデル有機体として使用できます。
最後に、利用可能な遺伝的ツールの広大な配列と組み合わせて、動作を監視する高スループット メソッドのアクセシビリティをショウジョウバエなど複雑な行動を制御する脳の領域を識別するための選択のモデル生物学習、記憶、睡眠、求愛、口渇等36,37,38,39。ハエの遺伝学者の「ツールボックス」の中心には特に役に立つツールの 1 つは、GAL4/UA システム (図 2) です。このシステム40,41は、遺伝子または遺伝子下流の上流活性化シーケンス (UAS) の発現を増強するのに Gal4 転写活性化因子の組織特異的発現を使用します。このシステムの変更は、たとえば、正確に特定のニューロン42,43、過剰または関心44,の特定の遺伝子をノックダウンの興奮性を制御する研究者を許可している45、リアルタイムのカルシウム動態体内46を分析し、神経系統41をマークするレポーター遺伝子を表現。分裂の再結合が抑制型セル マーカー (MARCM) システム12,47モザイク解析の作成も許可と GAL4/UAS システムの組み合わせ。MARCM は、単一ニューロン トレースで軸索ガイダンス12,47に必要な細胞のシグナリングのコンポーネントを識別するために広く使用されています。これらおよび他の技術は、神経系の働きに必要な細胞メカニズムに関する貴重な洞察力の数を提供している、ほとんどが必要; 最初ショウジョウバエ脳の解剖脳を慎重に除去が頭脳の地域間の正しい脳形態と接続パターンを保持する必要です。次のプロトコルを使用して、きのこ体と光受容ニューロン例として神経集団に従って郭清と免疫蛍光染色大人のショウジョウバエ脳します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

神経系の開発には、いくつかのシグナル伝達経路と制御ネットワークによって調整されますイベントの一連が含まれます。これらの経路に関与するタンパク質の多くは哺乳類とミバエショウジョウバエ、似たような組織化原理がこれらの開発中に存在することを示唆しているように、他の真核生物の間保存されました。生物。重要なは、ショウジョウバエは、神経新生、分化、軸索誘導、シナプス形成を含む哺乳類に必要なプロセスを制御する細胞・分子メカニズムを識別するために広く使用されています。ハエは、様々 な人間の神経疾患をモデルに正常に使用されているも。ここで順を追ってレーザーマイクロダイ セクション、固定、および大人のショウジョウバエ脳内のタンパク質の蛍光ローカリゼーションのプロトコルについて述べる。このプロトコルでは、2 例の神経集団、きのこ体神経および網膜光受容体に焦点を当てし、抑制型セル マーカー (MARCM) を用いたモザイク解析を使用して個々 のきのこ体ニューロンをトレースするオプションの手順が含まれています。野生型と変異型の両方の脳からサンプル データが軸索ガイダンス欠陥の採点基準の簡単な説明と共に表示されます。このプロトコルは、きのこ体光受容器ニューロン、他のショウジョウバエの脳と他の頭脳領域内の蛋白質の局在化の形態を調査するため 2 つの確立された抗体を強調表示することができます。このプロトコルを使用して調査しました。

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.1K ビュー.  The College of Wooster. このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

発生生物学

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

フルーツフライを飼育<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;無菌およびノトバイオート条件の下で

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

マウス胎児腎臓の解剖および培養

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける内分泌破壊を試験する方法

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

ショウジョウバエメラノガスターにおける血液脳関門完全性に関するアッセイ

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...