この方法は、タンパク質修飾の分野で重要なツールを提供し、抗体薬物コンジュゲートの容易で効率的な生成を可能にします。この技術の主な利点は、取り扱いの容易さ、抗体産生の高収率、精神病反応の速度、および形成されたリンケージの安定性である。テキスト プロトコルで説明されているように、HEK サスペンション セルの拡張からこの手順を開始します。
1ミリリットル当たり250万個の細胞の密度に達したら、1モル水酸化ナトリウムにリジン(CpK)のシクロプロペン誘導体の新しい溶液を調製する。抗生物質を添加した発現培地に2.5ミリリットルのCpKを加える。溶液をよく混ぜ、1モルHClの250マイクロリットルを加え、22ミクロンのフィルターを使用して溶液を殺菌する。
現在、500 x gで5分間、目標密度で1億2500万個の細胞を遠心分離する。遠心分離後、CpKを含む発現培地にDNAトランスフェクション試薬混合物を添加し、この培地を使用して細胞を再懸濁する。CpKを添加してから6~7日後、3,000xgで細胞を遠心分離機で上清からトラスツズマブを収穫する。
次に、上清をフィルター処理します。今250ミリリットル円錐形のチューブに5xビーズ洗浄バッファーを追加し、上清と混合し、予備平衡化タンパク質A樹脂を追加します。円錐形のチューブをローラーの上に室温で3時間置き、抗体と上清を引き下げる。
インキュベーションに続いて、上清を含むタンパク質A樹脂をカラムに移し、液体を通して流れるようにする。その後、洗浄バッファーの25ミリリットルを追加し、それを通して流れるようにします。1モルリン酸緩衝液1ミリリットル、塩化ナトリウム150ミリモルを回収管に加え、4ミリリットルのクエン酸ナトリウム1000で抗体を溶出する。
酸性溶液は、コレクションチューブに既に存在する塩基性溶液によってカラムから外れるとすぐに中和されます。次に、抗体を10ミリリットルのPBSで希釈する。遠心ろ過により抗体を5~1ミリリットルに濃縮し、バッファーをPBSと3回交換します。
30分間にわたって高塩バッファーで低塩バッファーのゼロから 100% 勾配を持つブチル疎水性相互作用カラムを使用して FPLC によってサンプルを精製します。すべての分画を収集し、280ナノメートルで溶出を監視します。遠心濾過により抗体を含む分画を濃縮し、PBSと3回バッファーを交換します。
抗体は、その後、摂氏4度で保存することができます。モノメチルオウリスタチンE、またはMMAEは、非常に有毒である。そのため、MMAE誘導体を扱う際には手袋とゴーグルを使用してください。
コントロールとして変更されていない MMAE を使用する場合は、MSO でストックソリューションを準備する際に、ヒュームフードの内側に固体製品を処理します。テトラジンの結合分子と抗体を結合するには、抗体当たりテトラジンMMAEの10モル等価を、20マイクロリットルのアセトニトリルと76マイクロリットルのPBSを小さな円錐形のチューブに希釈する。トラスツズマブベアリングCPKに1モル相当を加えます。
徹底的に混合し、MMAEにリンクトラスツズマブを形成するために室温で3時間反応させます.MMAE以外の分子は、潜在的に大きく、より立体的に妨げられ、このプロトコルを使用して抗体にリンクすることができる。反応の全容をスピンカラムに加え、遠心分離機を1500 x gで1分間追加します。
コンジュゲートを解析するには、HPLC HICカラムを100%高塩バッファーで5分間平衡化します。その後、1ミリリットルの1ミリリットルのトラスツズマブ溶液をMMAEにリンクし、バイアル内に2X高塩バッファーの15マイクロリットルを混合します。混合物をHPLCカラムに注入します。
1分間100%高塩バッファーを有する1分あたり1ミリリットルの等角流でエルテ。低塩バッファーの高塩バッファーの 100 からゼロ パーセントの 15 分の勾配でこれに従ってください。280ナノメートルで溶出を監視します。
クロマトグラムのピークを保持時間7.5、9.2、および11.5分と統合し、トラスツズマブにそれぞれゼロ、1、および2つの共役毒素を持つ。次に、重みが 1 分の 9.2 分、重さが 2 の 10.5 分で、3 つのピークの合計面積で除算することで、DAR を計算します。LC-MSによるコンジュゲートを解析するために、まず、37°Cで少なくとも6時間PNGase Fの250単位を用いて非還元条件で1ミリグラムの30マイクロリットル/ミリリットルおよび非還元条件で無修飾抗体を脱グリコシル化した。
血清を解凍し、22ミクロンのフィルターを通してそれを濾過します。その後、96ウェルプレートの外部井戸に水を充填します。中央の井戸では、PBSの1ミリリットルトラスツズマブテトラメチルrhodaアミンあたり1ミリグラムの10マイクロリットルを1ミリリットルの血清の90マイクロリットルを、1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度で混合する。
湿度が37°C、CO24%で飽和したインキュベーターにプレートを置きます。5日間を通して24時間ごとに、ピペットはそれぞれよく完全に混合し、5マイクロリットルのアリコートを取る。フラッシュは液体窒素でアリコートを凍結し、摂氏80度で保存します。
すべてのサンプルが収集されたら、テキストプロトコルで詳述されているように、アリコートを解凍し、間接的なELISAを使用して分析します。あるいは、市販のELISAキットを用い、ADCの濃度を測定することができる。アッセイの2日前に、96ウェルプレートの外側の井戸に水を充填します。
その後、5ミリモルEDTAで05%トリプシンを有する細胞を持ち上げる。250 x gで細胞を3分間遠心分離し、新しい培地で再懸濁する。その後、96ウェルプレートでウェルあたり100マイクロリットルに3,000個の細胞を播種し、インキュベーターに戻します。
細胞を播種した2日後、完全培地で1%DMSOを三重に全サンプルの連続希釈を調製する。各サンプルの100マイクロリットルを各ウェルに加え、摂氏37度と4%のCO2で5日間インキュベートします。5日目に、細胞の生存率を測定します。
この目的のために、市販のキットを使用して細胞をライスし、放出されたATPを測定する。1%DMSOで処理されたコントロールセルに対するシグナルの割合をプロットします。ADCは、血清中で5日間摂氏37度でインキュベートし、機能安定性を証明するために細胞毒性についてアッセイすることができます。
シクロプロペンハンドルを有する抗体は、タンパク質A精製後に1リットル当たり20ミリグラムを超える収率を有するこの手順を使用して得ることができる。産生される抗体は、テトラジンを持つ毒素に迅速かつ部位特異的に共役することができる。抗体を毒素と共役させると、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより測定される平均薬物対抗体比は1.9より大きい。
ADCのアイデンティティは質量分析によって確認される。生成されたジヒドロピリジジン結合は、摂氏37度で5日間にわたってヒト血清中で安定している。抗体薬物コンジュゲートは強力であり、HER2のレベルが低い細胞ではなく、高レベルのHER2を有する細胞を選択的に殺す。
さらに、テトラジンリンカーで修飾された毒素および毒素を含まない抗体は、毒性が非常に低い。毒素単独は、選択性を達成するために標的化の必要性を強調する非HER2依存性毒性を示す。この手順に従って、我々は迅速かつ効率的に腫瘍の治療のための抗体薬物コンジュゲートを調製することができます。
潜在的に、テトラジンで機能する任意の薬物は、癌細胞バイオマーカーを標的とする任意の抗体にリンクすることができる。この技術の意味は、治療または診断を目的としたタンパク質コンジュゲートに及びます。
