この手順の全体的な目標は、非正規アミノ酸の組み込みとクリック化学を組み合わせることによって均質なグリココンジュゲートワクチンを製造することです。遺伝子コードの拡張は、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込み、その特性を改変したり、新しいタンパク質機能を研究または作成したり、タンパク質コンジュゲートにアクセスしたりするための強力なツールです。コドン抑制法は、異なる位置に非天然アミノ酸を組み込むための最も一般的な方法として登場しています。
この方法論は、生体直交性官能基を抱える非天然アミノ酸を含むタンパク質担体の生産に適用される。この反応性ハンドルは、次に、合成オリゴ糖ハプテンを特異的かつ効率的に移植し、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために使用することができる。プロパギルリジン,PrK,市販のボックリジンから2段階で合成される。
第1のステップでは、ボックリジンの無保護アミノ基がクロロホルメートのプロバルギルに変換される。第2のステップでは、αアミノ基は非保護される。N(α)ボク・プロパーギル・リジンを合成するには、まず5ミリリットルの水性1モルNaOHと5ミリリットルのTHFをフラスコに混合して500ミリグラムのボックリジンをフラスコに溶解し、フラスコをシリコン中隔でフィットさせます。
氷浴でフラスコを冷やし、粉末が溶けるのを待ちます。次に、プロバルギルクロロホルメートを攪拌下で2〜3分間にわたって滴下して加えます。反応混合物を室温で温め、10時間撹拌を続ける。
ジエチルエーテル、水性モル塩酸、酢酸エチルの冷却液。粗反応混合物を氷浴で冷まします。分離漏斗で混合物を注ぎます。
50ミリリットルのジエチルエーテルと混合物を抽出します。抽出は圧力の蓄積をもたらし、圧力の蓄積を頻繁に解放することを確認してください。水相を回収し、有機層を廃棄する。
慎重に追加, 分離漏斗の水相に1モル塩酸の50ミリリットル.次いで、酢酸エチルの30ミリリットルを用いて水層を2回抽出する。有機相を収集し、TLCによって化合物の存在を確認します。
この段階では、有機相にあるべきである。結合した有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させます。固相をフィルタオフします。
そして、ロータリーエバポレーターに減圧下で濾液を濃縮します。粗油性N(α)の試料を重水素化クロロホルムに溶解し、NMRによってその同一性を制御する。プロパーギルL-リジンを合成するには、中隔を備えた丸いボタンフラスコにN(α)Boc-propargyl-リジンを導入する。
アルゴンの下のフラスコに4ミリリットルの無水ジクロロメタンを加えます。攪拌下でトリフルオロ酢酸の滴方向、4ミリリットルを追加します。TFAがシリコン中隔を損傷するのを防ぐために、ガラス蓋用のシリコン中隔を交換してください。
反応混合物を室温で1時間かき混ぜます。TLC による Boc-PrK の保護解除を確認します。反応混合物を減圧下で濃縮する。
粗残渣にジエチルエーテルを加えます。フリットガラス上の白色固体の形でプロパーギル-L-リジンをフィルターします。プロパーギルL-リジンのアリコートを重水素酸化物に溶解し、そのアイデンティティと純度を制御するためにNMR分析を行う。
プロパーギルL-リジンは、100ミリモルの最終濃度で蒸留水に溶解し、1ミリリットルのアリコートでマイナス20度で保存されます。プラスミドを発現株に同時変換するには、5分間に氷上で化学的に有能な大腸菌BL21の100マイクロリットルのアリコートを解凍する。各プラスミドの1マイクロリットルまたはそれぞれ100〜100ナノグラムを細胞に加え、氷の上で30分間インキュベートします。
45秒間、42度で有能な細胞をインキュベートします。その後、2分間氷の上に戻します。900マイクロリットルのLB培地を加え、37度で1時間揺れ下でインキュベートし、抗生物質の発現を可能にする。
その後、抗生物質でLB寒天に変換された細菌をプレートします。細菌は37度で一晩成長することができます。PrKで修飾されたタンパク質を発現させるために、抗生物質を用いてLB培地の5ミリリットルで単一の共形化コロニーを接種する。
揺れで37度で一晩インキュベート。翌日、抗生物質を含む自動誘導培地の500ミリリットル、Lアラビノースの0.02%、PrKの1ミリモルで一次培養の5ミリリットルで希釈し、揺れの下で24時間37度でインキュベートする。野生型タンパク質遺伝子を含むクローンの培養を行うことによりPrKを行わずに培養を行い、陽性対照を行うことにより陰性対照を挙げられる。
10分間に5,000xgで遠心分離により一晩培養から細胞を収穫する。上清を捨て、ペレットをマイナス20度で凍らせます。重力フローベンチアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質の精製のために、細胞ペレットを20ミリリットルの溶解バッファーに再懸濁させる。
DNase Iとリソザイムを加え、30分間に37度で懸濁液をインキュベートしてリシスを可能にする。5分間に氷中の細胞を超音波処理し、30分間に20,000 x gで遠心分離によって細胞の破片を取り除きます。0.45マイクロメートルフィルターで溶精液を濾過Ni-NTA樹脂をサスペンションに加えます。
4度で1時間やさしく混ぜます。ポリプロピレンカラムに懸濁液を注ぎ、非結合分画を収集します。樹脂を10ミリリットルで洗い、次に5ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄します。
洗浄画分を収集します。1ミリメートルの溶出バッファーでHisタグ付きタンパク質をエルテし、このステップを4回繰り返し、すべての追加分画を収集します。純粋なヒスチジンタグ付きタンパク質を含む分数を組み合わせ、透析膜を使用して一晩TEVプロテアーゼバッファーの1リットルにそれを透析します。
タンパク質サンプルを50ミリリットルチューブに集め、TEVバッファーを加えて、1ミリリットルの最終体積で1ミリリットル当たり2ミリグラムの最終濃度を得る。TEVプロテアーゼを100マイクロリットル加えます。0.1モルDTTの50マイクロリットルを加えます。
最大5ミリリットルのTEVバッファーを完備。ゆっくりと揺れで、4度で一晩インキュベートします。EDTAを除去するために、透析膜および5ミリモルイミダゾールのリン酸緩衝液を使用して、タンパク質を一晩4度で透析する。
TEVプロテアーゼと未消化タンパク質を排除するには、Ni-NTAビーズと混合をインキュベートし、4度で1時間穏やかに混ぜます。懸濁液をポリプロピレンカラムに注ぎます。非連結分数を収集しました。
TEVプロテアーゼおよび未消化タンパク質はビーズに結合したままであり、消化されたタンパク質は溶出する。5ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを洗い、同様に洗浄分数を収集します。消化されたタンパク質を透析膜で一晩4度で1リットルのクリックバッファに対して透析し、イミダゾールを除去し、バッファーを交換します。
そして280ナノメートルでタンパク質の濃度を測定する。6-六クロロ-フルオレセインアジド、または解毒剤機能化炭水化物抗原と共役するために、PrK変異タンパク質を57.8マイクロモルの濃度で2ミリリットルマイクロチューブに入れる。5ミリモルアジド化合物の10マイクロリットルを追加し、その後、硫酸銅溶液とTHPTAのプレミックスを追加します。
塩酸塩のアミノグアニジンを追加します。.アスコルビン酸ナトリウムの水溶液を即日調製した添加物。チューブを閉じ、数回反転して混ぜ、室温で2時間インキュベートします。
EDTAを添加して反応を停止する。SDS ページの結合を確認してください。移動後、312ナノメートルのUV光のゲルを蛍光体と共役に視覚化します。
クーマシーブルーでゲルを染色するか、糖質抗原と共役を可視化する。ハプテンの添加としては、分子量の変化を誘発すべきである。糖コンジュゲートをPBSと平衡させたゲル濾過カラムに塗布して精製します。
グリココンジュゲートを含む分画を収集します。長期保存のために、蒸留水に対してグリココンジュゲートを透析し、次に凍結乾燥し、マイナス80度でグリココンジュゲートを保存します。PrKはPsaAのN末語の近くでリジンの置換で位置32で導入された。
mPsaA産生の有効性は、抗ヒスチジンタグ抗体を用いたSDSページおよびウェスタンブロット分析によって確認された。完全長タンパク質の存在は、PrKの正常な組み込みを強く示す。しかし、強度は野生型のmpPsaAに対して観察された強度よりも低い。
mPsaA(K32PrK)はニ・ンタビーズで精製されています。典型的な収量8ミリグラムとPrK残渣の組み込みにより、最終的に質量分析法によって確認された。ヒスチジンタグを、TEVプロテアーゼを用いたタンパク質分解切断時に除去した。
mpPsaA(K32PrK)を有するアルキンの反応性をアジド機能フルオレセインを用いて評価し、さらに合成オリゴ糖抗原を共役させるために使用した。実験は、コントロールとして野生型のmpPsaAと比較して行われました。最後に、グリココンジュゲートをゲル濾過により精製し、その同一性を質量分析法により確認した。
本プロジェクトでは、アンバーストップコドン抑制技術を用いて、定義された部位下に不天然アミノ酸を組み込む均質なグリコジュエン酸ワクチンを調製した。グリココンジュゲートワクチンの均質性は、完全な物理化学的特徴付けを確実にする重要な基準です。そして、それによって、ますます要求の厳しい薬物機関の勧告を満たす。
この基準は、古典的な純粋結合法を用いて満たされない。また、このプロトコルは、グリココンジュゲートワクチンの構造を細かく調整することを可能にする。グリココンジュゲートの均質性と構造の関係を研究する前例のないツールを生み出す。
