Name: a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion
Uploaded: 2018-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
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この研究は、NIH/NIAID AI112423 とベンジャミン ・ k ・陳に NIH/日の出 GM113885、タリア h. シュワルツに NIH/NIAID K08 AI120806 の補助金によって支えられました。マウント シナイ ディーン流れ Cytometry コアで、Icahn 医学部に感謝したいと思います。

1. ターゲット細胞の生成
注: この手順は省略可能です。既存の RG ターゲットのセルラインを使用している場合は、手順 2 で開始します。
<ol><li>293 t 細胞11 [ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) を 10 mL]10 pCL 10A1 の pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE で12 (包装プラスミド) の 70% コンフルエント 10 cm プレートを cotransfect、1:1 の比率 (合計 20 μ g) カルシウム ベースのトランスフェクション13を使用しています。</li>
	<li>15 mL の円錐管にプレートからメディアをピペッティングし、細胞の残骸をペレットに 23 ° C で 5 分間 3,000 x gでチューブを遠心分離ウイルスの培養上清中の 48 時間後トランスフェクションの 10 mL を収穫します。</li>
	<li>0.45 μ m フィルターを 10 mL の注射器に接続します。遠心分離の後全体の上澄みを取るし、注射器を読み込みます。きれいな 15 mL チューブにサンプルを実行します。</li>
	<li>適切なサイズにフィルターのウイルス上清の約数 (通常、0.5-1 ml)。これらがすぐに次の手順で使用するまたは-80 ° C で凍結して格納できます。</li>
	<li>96 ウェル プレートで好みのセルラインに感染するのにウイルス上清の 50-100 μ L を使用します。5% CO2と 37 ° C で培養します。RFP 信号 (40 倍の倍率、532 nm 励起、588 nm 発光) 蛍光顕微鏡下で 24 h とすぐに表示されますが、最大 72 時間かかる場合があります。 注: これらの実験 Jurkat 細胞が使用されたが、他の種類を同様に使用することがあります。</li>
	<li>10 井戸のシリーズを設定するピューロマイシンとよく少なくとも 1 を残し、各追加ピューロマイシン導入されたセルを選択します (5 μ g/mL に 0.5 μ G/ml の濃度の範囲を使用します。 セルの種類ごとに異なることがあります) コントロールとして放置。細胞生存率 (ピューロマイシン抵抗なくセルでセル換散が発生) の数日間のコース上と比較して監視無処理と使用ピューロマイシン RFP 発現細胞のみが生き残るための濃度。 注: は、transfected セル存続間融合細胞が殺されている濃度を選択します。</li>
	<li>単一セル流れ cytometry 並べ替えまたは限界希釈を使用して (1.8-1.10 のステップを参照)、(成長に数週間かかる場合があります) 細胞ラインを開発する単一セル1から派生した文化を育てます。</li>
	<li>希釈法を使用する場合、診断を使用してセルをカウントし、約 500 セル/mL にサンプルを希釈します。</li>
	<li>96 ウェル プレート [10 %fbs と 2% ペニシリン ストレプトマイシン、Jurkat 細胞を用いた場合とロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 中] メディアの 50 μ L にセル希釈の 50 μ L をピペットし、メディアの 50 μ L を含む 11 の井戸に 1:1 のシリアル希薄を実行します。最高の結果を得るのため、少なくとも 10 のレプリケートを実行します。</li>
	<li>組織文化のインキュベーター (5% CO2と 37 ° C) で、約 4 週間のプレートの顕微鏡 (40 X) を介して細胞の成長を監視します。クローンのカルチャ (顕微鏡で見られる、40 X) として成長と最低ピューロマイシン濃度から文化を選択します。</li>
	<li>23 ° C で 5 分間 800 x gで文化 (500,000 細胞/ml、診断とカウント) の 20 mL を遠心、500 μ L の 10 %dmso と FBS の再採取を固定します。-80 ° c 細胞凍結コンテナーを使用し、液体窒素中で保存します。</li>
</ol>2. 細胞ウイルス感染
<ol><li>
標的細胞の調製
	<ol>
<li>37 ° C の水のお風呂に入れて Jurkat RG レポーター細胞の融解 1 つ 500 μ L バイアル。RPMI 完全培地 10 mL に、バイアルから細胞をピペットおよび 23 ° C で 5 分間 800 x gで混合物を遠心分離T-75 フラスコ RPMI 完全培地 20 mL にペレットを再懸濁します。フラスコは一晩 (37 ° C、5% CO2) 孵化させなさい。 注: RPMI 完全培地には、RPMI 1640、10 %fbs、2 mM L グルタミン、100 単位/ml ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg/mL が含まれています。</li>
		<li>次の日は、ピューロマイシン (メディアの 8 mL あたり 2 mg/mL のストックの 1 μ L) の 0.5 μ g/mL を追加します。200,000-800,000 細胞/ml (カウントを介して検定) の密度を維持する、細胞を培養します。</li>
		<li>転送アッセイを設定する前に日は、新鮮な RPMI 培ピューロマイシンの 0.5 μ G/ml で 200,000 – 400,000 セル/mL までセルを分割します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ドナー細胞の調製
	<ol>
<li>Untransduced Jurkat 細胞および文化媒体 (前述の手順 2.1)、200,000-800,000 細胞/ml の密度を維持を完了 RPMI の 20 ml T-75 フラスコでそれらを解凍します。</li>
		<li>7,500,000 細胞 (800 x gで 5 分) を遠心し、サプリメントと nucleofection ソリューション V 120 μ でそれらを再懸濁します (材料の表を参照してください)。エレクトロポレーション キュベットにセルを転送し、ギャグ本院1 DNA の 4.5 μ g を追加します。セルを transfect (エレクトロポレーション ベースのアプローチを介して材料表を参照してください) (例えばS-18) 適切なプログラムを使用して、その後すぐに RPMI 培地 3 mL に転送 (10 %fbs)。</li>
		<li>5% CO2と 37 ° C でそれらを一晩インキュベートして回復する細胞を許可します。</li>
		<li>次の朝、23 ° C で 5 分間 800 x gで細胞を遠心し、アッセイのセットアップに進む前に 37 ° c (5% CO2) 回復する 2 h をできるように RPMI 完全培地 3 mL にそれらを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
共培養
	<ol>
<li>(ドナー細胞ターゲット) の試金するにあたり 50,000 セル (800 x g 23 ° C で 5 分間) を検定し、スピンを使用してセルをカウントします。ピューロマイシンなしで完全に RPMI で 1 x 106セル/mL を再します。</li>
		<li>一皿で各井戸にドナー細胞懸濁液の 25 μ L を追加します。別の板で標的細胞の 25 μ L を追加します。</li>
		<li>各ウェルに適切な濃度で RPMI 完全培地で希釈した試験化合物の 25 μ L を追加します。30 分間化合物とドナーとターゲットの細胞を孵化させなさい。 注: 濃度は薬剤によって異なります。それに知られている IC50がある場合は、これを出発点、上と下を滴定として使用します。IC50が既知の場合は、10 μ M の最終的な集中の 200 μ M 在庫を準備します。</li>
		<li>前処理後、他に 1 つのプレートの内容をピペッティングによるドナー細胞と標的細胞を組み合わせて、5% CO2と 37 ° C で培養のインキュベーターで 40 h 細胞をインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フローサイトメトリー
	<ol>
<li>パラホルムアルデヒド (PFA) を最終濃度 2% の各ウェルに追加します。 注: ストック溶液の 16%、これも 100 μ L あたり 14 μ L。</li>
		<li>注意: PFA は露出した皮膚や目に有害であります。実験用の上着、手袋と安全メガネを着用し、安全フードの原液を処理します。</li>
		<li>MCherry と FITC チャンネル流れの cytometer で細胞を読みます。 注: 感染細胞対の背景の上に GFP を発現する細胞の 5-20% を参照してくださいすることが可能です。感染していない細胞。</li>
		<li>蛍光顕微鏡 (40 X) GFP 固有のチャネル上で GFP シグナルを可視化 (400 の励起フィルターと nm と 508 の排出フィルター nm)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 携帯無料ウイルス感染症代替プロトコル
<ol><li>
標的細胞の調製
	<ol>
<li>37 ° C の水のお風呂に置くことによって Jurkat RG レポーター細胞の融解 1 つ 500 μ L バイアル。RPMI 完全培地 10 mL に、バイアルから細胞をピペットし、RPMI 完全培地 23 ° C で 5 分間 800 × gで遠心分離T-75 フラスコ RPMI 完全培地 20 mL にペレットを再懸濁します。フラスコは一晩 (37 ° C、5% CO2) 孵化させなさい。</li>
		<li>次の日は、ピューロマイシン (メディアの 8 mL あたり 2 mg/mL のストックの 1 μ L) の 0.5 μ g/mL を追加します。200,000-800,000 細胞/ml (カウントを介して検定) の密度を維持する、細胞を培養します。</li>
		<li>転送アッセイを設定する前に日は、新鮮な RPMI 培ピューロマイシンの 0.5 μ G/ml で 200,000 – 400,000 セル/mL までセルを分割します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
携帯無料のウイルスの生産
	<ol>
<li>Transfect 293 t 細胞11の 70% コンフルエント 10 cm プレート (DMEM の 10 mL の 10% に FBS) カルシウム ベースのトランスフェクション13を使用してギャグ本院1プラスミドの 5 μ g で。 注: このスケールは約 2 〜 4 の 96 ウェル プレート、トランスフェクションの効率によって十分であるウイルスの 10 mL になります。</li>
		<li>15 mL の円錐管にプレートからメディアをピペッティングし、すべて細胞の残骸をペレットに 5 分間、3,000 x gでチューブを遠心分離によって 48 時間で全体のウイルス上清を収穫します。</li>
		<li>0.45 μ m フィルターを 10 mL の注射器に接続します。遠心分離の後全体の上澄みを取るし、注射器を読み込みます。きれいな 15 mL チューブにサンプルを実行します。</li>
		<li>ウイルスを使用して、ターゲットの細胞をすぐに (ステップ 3.3) に感染または凍結し、-80 ° c (使用する前に必要に応じてサンプルの雪解け) ウイルスを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
感染症
	<ol>
<li>(ステップ 3.1.3) から RG Jurkat 標的細胞を数えるピューロマイシンなし中 5 分あたり 800 x gでも 50,000 の標的細胞を検定とスピンを使用して、完了 RPMI で 1 × 106セル/ml に細胞を再します。</li>
		<li>一皿で各井戸に RG Jurkat 細胞の 25 μ L を追加します。別皿で 25 μ L を追加 (2 ng) 各ウェルにウイルス。</li>
		<li>各ウェルにメディアを適切な濃度に希釈テスト混合物の 25 μ L を追加します。セルと 30 分間化合物とは、ウイルスを孵化させなさい。 注: 試験濃度は薬物によって異なります。それに知られている IC50がある場合は、これを出発点、上と下を滴定として使用します。不明な場合は、最終濃度 10 μ M の 200 μ M 在庫中を準備します。</li>
		<li>前処理後、井戸から標的細胞にウイルス/複合ミックスのコンテンツ全体 (50 μ L) を追加し、5% CO2と 37 ° C で培養のインキュベーターで 40 h のためのすべてを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フローサイトメトリー
	<ol>
<li>PFA を最終濃度 2% の各ウェルに追加します。 注: ストック溶液の 16%、これも 100 μ L あたり 14 μ L。</li>
		<li>MCherry と FITC チャンネル流れの cytometer で細胞を読みます。Gfp は、GFP チャンネルの蛍光顕微鏡による可視化も可能です。 注: 一度感染細胞対の背景の上に GFP を発現する細胞の 5-20% を見ると期待できます。感染していない細胞。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Cre-lox+activated+viral+membrane+fusion+assay+identifies+pharmacological+inhibitors+of+HIV+entry.">A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry.</a> Virology. 490, 6-16 (2016).</li><li>Cavrois, M., De Noronha, C., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+enzyme-based+assay+detecting+HIV-1+virion+fusion+in+primary+T+lymphocytes.">A sensitive and specific enzyme-based assay detecting HIV-1 virion fusion in primary T lymphocytes.</a> Nature Biotechnology. 20, 1151-1154 (2002).</li><li>Huerta, L., Lamoyi, E., Baez-Saldana, A., Larralde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+envelope-dependent+cell-cell+fusion:+a+quantitative+fluorescence+cytometric+assay.">Human immunodeficiency virus envelope-dependent cell-cell fusion: a quantitative fluorescence cytometric assay.</a> Cytometry. 47, 100-106 (2002).</li><li>Sakamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+HIV+cell-cell+fusion+assay+by+using+two+genetically+modified+HeLa+cell+lines+and+reporter+gene.">Establishment of an HIV cell-cell fusion assay by using two genetically modified HeLa cell lines and reporter gene.</a> Journal of Virological Methods. 114, 159-166 (2003).</li><li>Herschhorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+cell-cell+fusion+system+with+integrated+ability+to+measure+the+efficiency+and+specificity+of+HIV-1+entry+inhibitors.">An inducible cell-cell fusion system with integrated ability to measure the efficiency and specificity of HIV-1 entry inhibitors.</a> PLoS One. 6, e26731 (2011).</li><li>Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X-selective+purinergic+antagonists+are+strong+inhibitors+of+HIV-1+fusion+during+both+cell-to-cell+and+cell-free+infection.">P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection.</a> Journal of Virology. 88, 11504-11515 (2014).</li><li>Marin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+HIV-Cell+Fusion+Assay+for+Discovery+of+Virus+Entry+Inhibitors.">High-Throughput HIV-Cell Fusion Assay for Discovery of Virus Entry Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13, 155-166 (2015).</li><li>Giroud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+Functional+Profiling+of+Small-Molecule+HIV-1+Entry+and+Fusion+Inhibitors.">Screening and Functional Profiling of Small-Molecule HIV-1 Entry and Fusion Inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 15, 53-63 (2017).</li><li>Hubner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent,+fluorescently+tagged+HIV-1.">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> Journal of Virology. 81, 12596-12607 (2007).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9, 81-83 (2011).</li><li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection.">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, 8392-8396 (1993).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+Rapid+production+of+helper-free,+high+titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses.</a> Journal of Virology. 70, 5701-5705 (1996).</li><li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Phosphate+Transfection.">Calcium Phosphate Transfection.</a> Current Protocols in Immunology. 10, 10-13 (2001).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ギャグ本院アッセイはウイルス複製の融合段階を阻害することが薬剤の候補者をスクリーニングするため非常に有用であると証明しました。この分析を実行すると、良好な信号を取得する最も重要なステップは、ほとんどのウイルス感染の試金に似ています。最初の重要なステップは、品質の良いウイルスの高価を作り出しています。この手順は、293 t 細胞が必要です継代頻度 (少なくとも?...

新規抗レトロ ウイルス療法の必要性 hiv-1 侵入阻害剤の高スループット スクリーンの開発を求めています。ギャグ本院レポーターの試金はホスト細胞膜1ウイルス膜融合を具体的に測定することにより細胞に感染システムの融合の段階でウイルス エントリの阻害剤を識別するために開発されています。アッセイを開発したウイルス膜融合の時点までの HIV-1 感染症の初期の段階で具体的に行動した新規阻害剤のスクリーニング。感染細胞を測定する課題の 1 つですので、新しい感染の測定は入力セルから区別することは困難に、初期接種が感染ドナー細胞と ininfected ターゲット細胞に含まれています。理想的なシステムは、ドナー細胞の存在しないターゲット細胞感染症の開始によって誘導されうる異種の遺伝子マーカーを伴うでしょう。ウイルス蛋白質酵素融合、BlaM Vpr によるアッセイを混合人気バイラル コンテンツは、効果的、細胞スクリーニング2高スループットの制限があります。このアッセイには、β-ラクタマーゼ (バーン) レポーターの遺伝子で HIV 1 Vpr を融合、粒子にパッケージ化され、ウイルスの膜融合に標的細胞に配信が含まれます。基板 CCF2 AM は標的細胞の細胞質に読み込まれ、胸の谷間に蛍光シフトを受けます。CCF2 AM 基板は高価な法外な高スループット画面のためすることができます。ドナーとターゲットの細胞を区別するために色素ラベルする必要がある対象とする集団。最後に、プロトコルには、負担と高価なことができる多数の化合物をテストするとき、洗って、インキュベーションのいくつかの手順が必要です。
ギャグ本院アッセイは、高スループットの融合細胞間伝達の阻害剤のスクリーニングを開発する、これらの問題への解決策として開発されました。このシステムには、セルに読み込まれる基板は不要です。アッセイ無細胞研究も使えます、擬似型の HIV-1 ギャグ-本院ウイルス粒子を用いた他のウイルス融合研究に適応可能です。HIV Env を介した細胞融合アッセイは、しかし、これらは HIV 1 ギャグ-本院アッセイは3,4、5実際ウイルス粒子を使用しないでくださいウイルス Env 蛋白質による細胞融合を測定できます。この試金は流れの cytometry または蛍光顕微鏡で読むことができます。それは、正常にプリン阻害剤1,6の小さな図書館と同様に FDA ライブラリ画面に使用されています。他の研究者は、プリンを細胞質7,8ウイルス カプセル化 β-ラクタマーゼの転送を報告する適応し、最適化された高スループットの融合アッセイを用いた HIV 1 融合阻害剤を識別したも.
ギャグ本院ウイルスは、行列と HIV 1 プロテアーゼ サイト9が並ぶキャプシドの Cre リコンビナーゼを挿入するギャグ iGFP ウイルスに似たようなアプローチで設計されました。Cre 酵素はウイルス粒子内の hiv-1 プロテアーゼは活性化が成熟するギャグのエンベロープタンパク質内に挿入される前駆体として行われます。したがって、Cre 配信は、ターゲット セルを介してウイルスの膜融合過程にプロテアーゼ活性化 HIV 1 粒子の内容の配信によって異なります。プロトコルの 2 つのバージョンは、ここで提供されます。最初は、HIV の直接の細胞間伝播を研究に標的細胞に感染するのに HIV-1 感染人口を使用します。2 番目のバージョンは、携帯無料のウイルスを研究するのに携帯無料のウイルスを使用します。細胞間伝達アッセイは、セルがフリーズ解除日から 7 日間または 5 日間場合セルはすでに解凍され、継代を取ります。無細胞感染試験は、細胞の解凍し、継代細胞を解凍する必要がある場合 5 日間、3 日間で実行できます。指示が Clevers ラボ10によって作成されたプラスミドを使用して目的のセル型 (既存 RG 対象のセルの行を使用していない) 場合で RG (赤・緑) ターゲット細胞ラインを生成するもあります。このアッセイでウイルス発現細胞とウイルス適切なバイオ セーフティの予防措置を取ることをお勧めします。このアッセイ BSL2 + 培養施設での感染部分を行っています。セルを修正した後は、標準的なフロー、フローサイトメトリーおよび顕微鏡施設で分析できます。
ここで説明画面への本法の適用する化合物の小説の HIV-1 ウイルス膜融合 (図 1) を阻害します。プリン受容体は、炎症性メディエーターです。当研究室は、プリン受容体非選択的阻害剤が HIV-1 ウイルス膜融合6の阻害剤として機能する実証されています。高スループットこのアッセイの使用率が新規 HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別できることを報告する.受容体のプリン クラスの阻害剤が HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤の新規クラスを表すことを示します。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5546</td><td>Media for 293 Cells</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td>Media for Jurkats</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Albumin</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>Serum for 293 Cells</td></tr><tr><td>Cosmic Calf Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.03</td><td>Serum for Jurkat Cells</td></tr><tr><td>Hyclone Pennecillin Streptomycin solution</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>SV30010</td><td>Penn/Strep used in both media</td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>3073</td><td>Used for Culture of Jurkat Cells</td></tr><tr><td>10 cm Tissue Culture Plates</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Used for Culture of 293 Cells</td></tr><tr><td>96 Well Plates (tissue culture Treated)</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>Used for fusion assay</td></tr><tr><td>Polyjet Transfection Reagent</td><td>Signagen</td><td>SL100688</td><td>Used to transfect 293 Cells</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-100ML</td><td>Used in wash steps</td></tr><tr><td>Hyclone Trypsin Protease</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>SH30042.01</td><td>For Trypsinization of 293 cells</td></tr><tr><td>Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>For Nucleofection of Jurkats</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare Life sciences</td><td>17144002</td><td>For Nucleofection of Jurkats</td></tr><tr><td>Serological Pipettes</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-11E</td><td>For all tissue culture</td></tr><tr><td>Pipettor Tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P3020-CPS</td><td>For all tissue culture and liquid handling steps</td></tr><tr><td>Millex Syringe Filter (0.45 &amp;mu;m)</td><td>Millipore</td><td>SLHA033</td><td>For filtration of virus</td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile syringes</td><td>BD Diagnostics</td><td>309656</td><td>For filtration of virus</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>2b</td><td>for Nucleofection of Jurkats (various models available)</td></tr><tr><td>BD Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>for flow cytometry analyss of samples</td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>Various models</td><td>Fortessa 2</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE</td><td>Addgene</td><td>32702</td><td>&lt;strong&gt;Koo BK&lt;em&gt; et al.&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt; Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods &lt;strong&gt;9:&lt;/strong&gt;81-83 (2011).</td></tr><tr><td>pCL10a1</td><td>Novus Bio</td><td>NBP2-29542</td><td>&lt;strong&gt;Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I&lt;/strong&gt;. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology &lt;strong&gt;70&lt;/strong&gt;: 5701-5705 (1996)</td></tr><tr><td>Gag-iCre</td><td>Benjamin Chen Lab</td><td></td><td>&lt;strong&gt;Esposito AM&lt;em&gt; et al.&lt;/em&gt; &lt;/strong&gt;A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology &lt;strong&gt;490:&lt;/strong&gt;6-16 (2016).</td></tr></tbody></table>

a high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of hiv-1 viral membrane fusion

この試金は流れの cytometry または蛍光顕微鏡による特に HIV 1 融合による緑色蛍光タンパク質 (GFP) 検出の式を報告する設計されています。HIV 1 記者ウイルス (HIV 1 ギャグ-本院)、Cre リコンビナーゼをマトリックスとギャグ エンベロープタンパク質のキャプシド蛋白質間の HIV-1 ゲノムに挿入することによって生成されます。ウイルス粒子に Cre リコンビナーゼ標的細胞にそれから解放されるこれのパッケージでこの結果の行、Cre リコンビナーゼ アクティブ赤色けい光たんぱく質 (RFP) GFP スイッチ カセットを安定に発現します。基底状態でこのカセットでは、RFP だけを表しています。次の標的細胞に Cre リコンビナーゼの配信、loxP サイトが並ぶ、RFP を切り取る、GFP の表現の結果します。この試金は無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順) の阻害剤をテストする使用ことができ、HIV-1 ウイルス膜融合の阻害物質としてプリン受容体拮抗薬のクラスを識別するために使用されています。

感染していない RG Jurkat 細胞は非常に強力な RFP の信号 (図 2 a、感染していない列) と背景 GFP 信号 (0.3%) の低レベルを展示します。ギャグ本院感染原因 1 HIV 融合阻害剤 AMD3100 の存在で GFP シグナル (24.9%) の増加 (20 μ M) は、この信号を感染していない背景レベル (0.34%) にまでもたらすの開発を阻害します。時逆転写阻害剤 AZT など後の融合イベン?...

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A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

HIV 1 融合を介して流れ cytometry または蛍光顕微鏡による検出可能な緑の蛍光蛋白質の表現を報告する細胞に基づく試金を記述します。無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順) の阻害剤をテストする使用できます。

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

a-high-throughput-cre-lox-activated-viral-membrane-fusion-assay-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.3K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Immunology Institute. HIV 1 融合を介して流れ cytometry または蛍光顕微鏡による検出可能な緑の蛍光蛋白質の表現を報告する細胞に基づく試金を記述します。無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順) の阻害剤をテストする使用できます。

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Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

免疫・感染学

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

単一粒子レベルでのウイルス融合動態の測定法

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

生物学

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection using a Multiparameter Optofluidic Platform

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience comorbidity related to chronic inflammation despite antiretroviral therapy. However, these inflammatory signaling has not been fully characterized. The role of early entry events on the activation of cellular signaling events and downstream gene expression has not been captured at the single-cell level. Here the authors describe a method that applies principles of live-cell fluorescence microscopy to an automated single-cell platform that cultures and images cells over user-customized time courses, allowing for high-throughput analysis of dynamic cellular processes. This assay can track single-cell live fluorescence microscopy of early events that immediately follow HIV-1 infection, notably the influx of calcium that accompanies exposure to the virus and the development of productive infection using a fluorescent reporter virus. MT-4 cells are loaded with a calcium-sensitive dye and cultured in isolated pens on a nanofluidic device. The cultured cells are infected with an HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). A fluorescence microscope positioned above the nanofluidic device measures calcium influx over an 8-min time course following acute HIV-1 exposure. HIV-1 productive infection is measured in those same cells over a 4-day interval. Imaging data from these time courses are analyzed to define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. The authors present an integrated, scalable alternative to traditional imaging methods using a novel optofluidic platform capable of single-cell sorting, culturing, imaging, and software automation. This assay can measure the kinetics of events under various conditions, including cell type, agonist, or antagonist effect, while measuring an array of parameters. This is the first established method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging: This technique can be broadly adapted to study cellular signaling kinetics and dynamic molecular interactions.

Here, we present a protocol in which single cells are monitored for acute events and productive HIV-1 infection on a nanofluidic device. Imaging data define virus-host receptor interactions and signaling pathway dynamics. This is the first method for nanofluidic high-throughput longitudinal single-cell culture and imaging to study signaling kinetics and molecular interactions.

多パラメータ光流体プラットフォームを用いたカルシウム流入とHIV-1感染の単細胞特性

HIV-1 causes a chronic infection that affects more than 37 million people worldwide. People living with human immunodeficiency virus (HIV) experience ...

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

Source: Tai, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

抗ウイルス化合物のスクリーニングのためのウイルス付着アッセイ

NOTE: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...