このプロトコルは、単一細胞レベルでリアルタイムの運動をキャプチャすることができます。私たちは、HIV感染に応答して個々の細胞パラメータを測定し、ウイルスライフサイクルの遅れたステップと早期のシグナル伝達イベントを関連付けることができます。これは、単一細胞の選別、培養、イメージング、およびソフトウェア自動化のための新しい光流体プラットフォームを使用した従来のイメージング方法に代わる、スケーラブルな統合型の代替手段です。
これは、ナノ流体、ハイスループット、縦単細胞培養およびイメージングのための最初の確立された方法です。この技術は、様々な疾患状態における細胞シグナル伝達動態および動的分子相互作用を研究するために広く採用することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションは、実験がどのように設定されているか、細胞がどのようにペンに光学的に分類され、どのようにチップを介して注入を設定するかを伝えるために重要です。
まず、100X濃縮洗剤溶剤25マイクロリットルと1,000X Fluo-4 AMの2.5マイクロリットルを1.5ミリリットルチューブに加え、次に渦を混合して、フレッシュフルー-4 AMローディング液を調製します。ピペット2.5ミリリットルの培養培地をローディング溶液に入れ、混ぜ合わせる。200万M MT-4細胞をGの500倍で3分間遠心し、その後、培地を取り除き、調製したFluo-4 AM負荷溶液の2ミリリットルでペレットを再懸濁します。
ピペットは細胞を35ミリメートルペトリ皿に再懸濁した。摂氏37度で15~30分インキュベートし、室温でさらに15~30分インキュベートします。細胞懸濁液を遠心分離管に移し、500倍Gで細胞を3分間遠心分離し、上清を取り除く。
培養培地の1ミリリットルにピペット化し、遠心分離機を500倍Gで3分間洗浄して細胞ペレットを再懸濁した。少なくとも50マイクロリットルの1ミリリットル当たり200万個の細胞の濃度で培養培地中でピペット処理することにより、細胞ペレットを再懸濁する。細胞ペニングを容易にする湿潤溶液でチップを調製するには、2ミリリットルの湿潤溶液と50ミリリットルの脱イオン水を含む遠心チューブを新しい光流体チップで器具に積み込み、チップに湿潤液をあふれさせるウェットチップ機能を実行します。
チップを摂氏50度でインキュベートし、チップを水で3回洗い流します。水の洗い流しが完了したら、250マイクロリットルの培養培地の3サイクルでチップを洗い流します。前のステップの細胞懸濁液を、負荷の前にF127洗浄剤溶質100個につき1個ずつ補充し、細胞がチップチャネルに付着する可能性を低減します。
器械輸出針を使用して、荷重操作と5マイクロリットルセルパッケージの体積のための少量インポートと1.5ミリリットル遠心管から細胞をインポートします。自動ペン機能を使用して最適化された光電子測位またはOEP電圧を使用したペンセルは、自動自動検出機能を使用してOEPケージで囲み、近くのペンに移動します。目的のセルが自動ペニングに続く場合は、手動ペン機能を使用してターゲットセルとターゲットペンを選択します。
ペニングが完了したら、250マイクロリットルの培養培地の3サイクルでチップを洗い流し、残りの未セプンセルをチップから取り除きます。細胞をペニングした後、FITC、テキサスレッドおよびDAPIチャネルの細胞の蛍光画像を得て、ベースラインFluo-4、mCherry、および自己蛍光を測定します。HIV-1を200万細胞当たり13ナノグラムのHIV-1 NLCIの濃度でマイクロチップに注入し、徐々に輸出針を通して懸濁液をチップに浸透させる。
HIV-1添加直後、FITCおよびDAPIチャネル内の画像を10分間の時間経過で繰り返し取得します。感染後1日、2日、3日、4日間でテキサスレッドチャンネルとDAPIチャンネルで画像を取得します。この方法論は、mCherry測定を介してHIV感染細胞および未感染細胞の同定およびクラスタリングに使用された。
mCherryシグナルの変化を有する細胞は、40,000以上の蛍光強度をそれぞれmCherry高またはmCherry低集団に集積した。これらのクラスターは、9分間の時間経過で蛍光4を使用して細胞内カルシウムを繰り返し測定することにより、カルシウム流入運動学について分析し、HIV感染細胞における初期のカルシウム流入を実証した。カルシウム流入とmCherryの蛍光との間には有意な正の相関が認められた。
この手順を試みる間、増殖した細胞はこのアッセイからのシグナルの劇的な減少をもたらすので、ウイルス産生と感染の両方の指数関数的増殖範囲内の細胞から始めることを覚えておくことが重要です。HIV-1での作業は危険です。したがって、この手順を実行する間、OSHA血液媒介病原体標準に示されているBSL-2の実践は、常に取られるべきです。
この技術は、制御された条件下で単一細胞の表皮または転写変化を研究できるようになるため、刺激的です。これは、多くの細胞型における分子経路に対する刺激の影響を相関させる広い可能性を秘めています。
