この方法は、脳構造におけるアストロサイトネットワークの組織に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、ラベルセルを数え、定義された構造内で解剖学的組織を文書化する公平な方法を提案することです。ImageJFIJI を開き、目的のファイルを選択し、バイオフォーマットのインポートオプションウィンドウで[OK]をクリックします。
最終的な Z スタックに必要な光学スライスのみを含む Z スタックを再定義するには、まず STK および Z プロジェクトを選択し、ツールバーのスタックノブをクリックします。投影タイプ設定で最大強度を選択します。ファイルを保存し、スタック ファイルに名前を付けます。
イメージングファイルに複数のチャンネルが含まれている場合は、画像カラーとスプリットチャンネルを使用して、アストロサイクネットワークの画像を持つチャンネルのみを表示します。ピクセル寸法の画像、プロパティ、ピクセルを選択して、画像のピクセル設定を確認します。次に、バックグラウンドのバックグラウンドツールを開いてバックグラウンドを減算し、背景を減算して、バックグラウンドバイオシチンのラベリングを除去します。
プレビュー機能を使用して、通常は 50 ピクセルに設定されるローリング ボールの半径を設定します。減算のバックグラウンドステップに従ってさらにノイズリダクションが必要な場合は、プロセス、ノイズを選択し、外れ値を削除します。[外れ値]設定で[明るい]を選択し、プレビュー機能を使用して半径としきい値を設定します。
次に示すように、外れ値除去ツールを使用するとデータがぼやける可能性があるため、注意してください。画像、調整、しきい値を使用してしきい値を調整します。デフォルトとBとWモードを選択します。
[適用]をクリックします。プロセス、バイナリを選択してバイナリプロセスツールを使用して画像をバイナリ画像に変換し、バイナリを作成します。ファイルを tiff ファイルとして保存し、バイナリ ファイルの名前を付けます。
セル数をカウントするには、まず[分析]をクリックして測定タイプを設定し、測定を設定します。次に、中心心のオプションを選択します。バイナリファイルが画面上で開かれていることを確認します。
ここでも、解析メニューを開き、今度はパーティクルの解析を選択します。次に、[表示とアウトライン] を選択します。これにより、検出結果を示す新しいファイルが生成されます。
検出を絞り込むためにパラメータを最適化します。セルのみを検出するには、30 ~ 6000 のサイズ値を使用し、0 ~ 1 の間の円形を使用します。[OK] をクリックして検出を実行します。2 つのテーブルが表示され、検出されたセルの数を示す集計表と、各セルの X 座標と Y 座標を提供する結果というタイトルのテーブルが表示されます。
値をコピーして、スプレッドシート アプリケーションに貼り付けます。このテーブルを名前検出テーブルの下に保存します。検出されたセルのプロットを含むファイルも表示されます。
このファイルを tiff ファイルとして名前検出ファイルに保存します。2 つ以上のラベル付きセルのグループが解析パーティクル ツールを使用して単一のセルとして検出された場合は、解析パーティクル ツールを適用する前に、プロセス、バイナリ、および集水域を選択してバイナリ イメージの集水域ツールを使用します。ネットワークの表面領域を測定するには、ImageJ の検出ファイルを使用します。
ツールバーでマウスを左クリックしてポリゴン選択ツールを選択します。もう一度左クリックすると、ネットワークの外部周辺にあるすべてのセルを接続する対象領域(ROI)のトレースが開始されます。右クリックしてポリゴンを閉じます。
設定した計測ウィンドウを開き、面積オプションを選択します。次に ROI マネージャを開き、[追加] をクリックして ROI マネージャにトレースされたポリゴンを追加します。ROI マネージャでメジャーをクリックして測定を実行します。
面積の計測値は表に表示され、ピクセル単位で表されます。この値を、平方マイクロメートルで値を取得するために使用される顕微鏡の変換係数で変換することを忘れないでください。ImageJFIJI でスタックファイルを開き、より強いラベル付け強度を持つパッチされたセルを特定します。
次に、スプレッドシート アプリケーションで検出テーブルという名前のファイルを開き、パッチを適用したセルとそれに対応する座標に関連付けられている番号を検索します。パッチされたセルを正確に特定できない場合は、ポリゴンツールを使用して、バイオシチンの堆積物の密度が高い領域を囲み、この位置をパッチされたセルの位置と呼ぶ。以前と同様に ROI マネージャを使用して、パッチが適用されたセルの場所に ROI を描画し、ROI マネージャに追加します。
次に、測定を設定し、中心のオプションを選択します。RIO マネージャで、メジャーをクリックして、トレースされた領域の中心座標を取得します。これらの座標をこの特定のネットワークの基準点として使用します。
この数式を使用して、パッチを適用したアストロサイトを参照して各セルの座標を計算します。パッチ付きアストロサイトを参照して各セルの座標を表現することは、パッチ付きアストロサイトからベクトルを計算する重要なステップである。この数式を使用して、優先方向の主ベクトルの座標を計算します。
ネットワークの優先方向の主ベクトルは、ネットワーク内で構成される各セルについて、以前に計算されたすべてのベクトルの合計です。メイン ベクトルの長さをネットワーク内のセルの数で除算し、パッチを適用したセルを除外するには、値を正規化し、ネットワーク間の比較を有効にします。対象の核内の各ネットワークの位置を決定するには、まずベクターイメージエディタで4つのx画像を開きます。
4 つの x イメージのサイズを大きくするには、ディメンション ウィンドウの寸法に 5 を掛けます。ここでは、画像を800 x 800ピクセルでサンプリングし、サンプリング解像度を4000 x 4000ピクセルに変更しました。ファイルを tiff 形式でエクスポートし、サイズが 4 x の名前を付けます。
サイズ変更した 4 つの x イメージの左上隅を、Adobe Illustrator ドキュメントの左下隅に合わせます。ソフトウェアは左下隅の参照点からの座標を提供します。ネットワークの 20 x イメージを開きます。
バイナリ ファイルまたは検出ファイルは、位置合わせが簡単であるため、使用します。次に、20 x イメージのバイナリ ファイルで不透明度ツールを使用して、サイズ変更された 4 つの x イメージに合わせて配置します。位置合わせが完了したら、ピペット ツールを選択して押さえたままにして、測定ツールが表示されるようにし、左側のツールバーで選択します。
測定ツールを使用して、20 x イメージの左上隅をクリックして、20 x 参照点の座標をサイズ変更した 4 つの x イメージ上に取得します。この20×参照座標は、核の模式図上の各ネットワークの位置を表すのに有用である。データを合計するために、核を長方形として正規化します。
これを行うには、ポリゴン ツールを使用して、サイズ変更された 4 つの x イメージ内の核を囲みます。次に、ROI マネージャを開き、描画された ROI を追加します。核の境界線が見えない場合は、透明なライトでイメージを使用します。
セット測定で、外接する長方形オプションを選択して、描画された核内の最小の長方形を計算します。最後に、measure をクリックし、書き込まれたプロトコルの手順に従って、外接する四角形で表される正規化された核でラベル付きセル座標を表現します。SR101によって標識された三叉主感覚核の側側部分の単一のアストロサイトを全細胞記録に標的とし、0.2%のバイオシチンで満たされた。
第5管の電気刺激は三叉主官能核の後部におけるバイオシチン標識を増加させ、結合細胞の数の増加を表す。占星状ネットワークは、三叉主感覚核の後部とその主な向きに閉じ込められたままである。この技術は、定義された構造内で占星ネットワークを位置付けるために開発されたが、任意の構造で標識された細胞の集団の位置を表現するために使用することができる。
