2013年に初めて記載されたクラリティ技術は、大量の細胞、血管、タンパク質なども厚い脳スライスで単一細胞分解能のサンプリングを可能にする組織クリアリング技術である。この技術は、脳全体を透明にすることによって、無傷の微視的構造の研究を可能にする。このプロトコルは、組織クリアのためのシンプルなチップと簡単なパイプラインです。
この技術は、脳組織に加えて、他のシステムにおける組織をクリアするために使用することができる。まず、パラフィルムを使用してチューブとキャップを密封し、キャップに2つの穴を穿刺します。次に、内径5ミリメートルのフレキシブルパイプと、その端に接続された19ゲージの針を使用して、タンクから窒素ガスを移送する。
チューブにパイプを取り付け、室温で30分間ガス交換を行うことで脱気を開始します。パイプを取り外し、すぐにモデリング粘土で穴を密封します。次いで、脱気密封管を37°Cの浴に3時間半移し、ヒドロゲル溶液を重合させた。
チューブから脳を取り出します。実験室用ワイプを使用して、脳の周りの重合ヒドロゲルを除去し、残留ゲルが脳の表面に付着したままにならないようにする。脳を、関心のあるすべての領域を含む厚いスライスに分割します。
スライスを最初の透明化溶液に入れ、摂氏37度で70RPMで24時間回転させてインキュベートする。その間に、脳を配置するための穴あきチューブを準備します。第2の透明化溶液を充填したビーカーに多孔管を攪拌装置上に入れる。
その後、ビーカーに脳を置き、漂白を防ぐためにアルミホイルで密封します。組織が透明になった後、脳をPBSTに移し、摂氏37度で24時間回転させながら摂氏37度でインキュベートする。溶液を新鮮なPBSTと交換し、さらに24時間インキュベーションを続ける。
その後、脳を室温で24時間PBSに移す。24時間後、PBSから脳を取り出し、屈折率整合溶液に移す。一晩摂氏37度で脳をインキュベートする。
まず、スライドの中央にサンプルを配置します。ホットグルーを使用して、スライドの端に組織とほぼ同じ高さの壁を作ります。角の1つに小さな隙間を残してください。
ホットグルー層が脳スライスの高さに近づいたら、屈折率マッチング溶液をサンプルに1〜2滴塗布して上面を湿らせ、気泡形成を防ぎます。ホットグルーがまだ液体である間は、カバースリップで上部を密封し、できるだけ均等に配置してから、チャンバーを屈折率マッチング溶液で満たします。熱い接着剤で隙間を塞ぎます。
ホットグルーの壁がスライドの境界を越えて伸びている場合は、伸びているエッジをカットします。撮影に油浸対物レンズを使用する場合は、カバースリップの上の壁にさらに2~3mmの接着剤を加えて、浸漬溶液を保持します。このプロトコルの後、脳組織はクリアされます。
マウス海馬のCA1領域におけるアストロサイトおよびニューロンの集団を視覚化するために、このプロトコルを使用して透明な脳スライスを調製した。すべてのアストロサイトはtdTomatoを発現し、興奮性ニューロンは核内でH2B-GFPを発現した。清澄化された組織のために調製されたチャンバーは、2つの光子または共焦点顕微鏡下での画像化に最適であった。
2つの光子顕微鏡を用いて、マウス海馬のCA1領域のクリアされた部分において300以上のアストロサイトが観察された。赤色の海馬アストロサイトと錐体細胞、緑色のソマタは目に見えて厚く、透明な組織であり、これら2つの細胞型間の空間的近接性を表している。走査型レーザー共焦点顕微鏡を用いて、興奮性ニューロンからの軸索束を半球全体にわたってトレースした。
緑色の束は背側海馬からスーパー乳房体に向かってトレースされた。赤い束は、母体から通気口海馬の起源に向かってトレースされました。温度、濃度、インキュベーション時間などの要因が、透明化手順の結果に影響を与えました。
したがって、プロトコルのすべてのステップにおける正確さは、透明な組織を達成する成功のために不可欠です。この技術を用いて、我々はいくつかの脳構造におけるニューロンとアストロサイトの間の距離を測定する。このプロトコールにより、以前の研究よりも2〜3桁多くの細胞の分析が可能になりました。
