この方法は、疾患および安定状態のシナプスにおけるアストロサイトニューロン相互作用の評価のための非常に微細なアストロサイトプロセスの可視化を容易にするために使用することができる。この手法は、マウスモデル、細胞集団、または脳領域にも適用できます。適切な抵抗を持つ鋭い電極を調製するには、マイクロピペットプーラーにフィラメントを持つホウケイ酸ガラス単一バレル電極を引っ張ります。
引っ張られた電極を閉じた容器に保管して、ほこりが先端に入るのを防ぎ、電極を箱の底から高く保ち、先端が壊れないようにします。電極にルシファーイエロー染料溶液を充填するには、先端を下向きにして垂直位置に電極を置き、電極の背面に1~2マイクロリットルのルシファーイエロー溶液をピペットします。電極の内側にルシファーイエローと接触して電極ホルダーの銀線をマニピュレータに接続した電極ホルダーに充填電極を静かに固定する前に、毛細管作用で溶液が先端に移動するまで5~10分待ちます。
染料放出試験では、軽く固定された脳スライスを室温で0.1モルPBSで満たされたガラス底皿にそっと入れ、ナイロン弦のプラチナハープでスライスを所定の位置に保持します。電極を電圧源に接続し、グランド電極を脳スライスを含む浴槽に入れる。共焦点顕微鏡の目的を対象の脳領域に移動し、10X水浸水レンズを使用して電極を溶液に下げ、電極を視野の中心に移動させます。
明視野照明の下で、電極が透明で、破片や気泡がないように、40X水浸漬レンズで電極を注意深く調べてください。488ナノメートルレーザーで共焦点レーザー走査顕微鏡に切り替えます。12ボルトで刺激装置をオンにして、染料の放出をテストします。
電極の先端の周りに大きな蛍光色素雲が見えるはずです。その後、明視野下では、電極をスライスに向かってゆっくりと下げ、表面のすぐ上で停止する。目的のアストロサイトをイオントフォアシスで満たすには、赤外線差動干渉コントラストを使用して、直径約10マイクロメートル、スライス面より40〜50マイクロメートル下の細長い楕円形のソマトンを有するアストロサイトを同定します。
これは、ピラミッド型細胞層の真下にある海馬の放射状層です。組織を移動すると、血管、ニューロン、アストロサイト、その他の細胞タイプが見えます。アストロサイトを選択したら、セルを視野の中心に移動し、電極先端をスライスにゆっくりと下げ、電極が細胞体と同じプレーンになるまで組織をナビゲートします。
アストロサイトの細胞体がはっきりと見えて輪郭を描いたら、電極をゆっくりと穏やかに前進させ、先端が細胞のソーマを突き刺すまで電極を動かす。目的の焦点をゆっくりと上下に動かして、電極がソーマの内側にあるかどうかを確認します。電極先端がセルの内側に入ったら、刺激器を0.5~1ボルトでオンにして、電流を連続的にセルに排出します。
共焦点顕微鏡を使用して、セルフィルムを見て、デジタルズームを増やして細胞の細部を視覚化し、必要に応じて電極の先端がセル内に見えるようにします。より細かい枝とプロセスが現れるまで約15分間待ってから、電圧をオフにしてセルから電極先端をそっと引き出します。充填されたセルを画像化するには、セルが元の形に戻るのを15〜20分待ってから、共焦点顕微鏡の設定を調整して、より細かい枝とプロセスが40倍の目的の下で定義されていることを確認します。
ステップサイズ0.3マイクロメートルのZスタックを設定し、セルからの信号がなくなるまでイメージング中に目的を移動させ、そのステップをトップに設定します。その後、目的を下に移動し、信号がなくなるまでセルを通してフォーカスし、そのステップを底に設定します。撮像が完了したら、電極で染料の放出を確認します。
大きな染料雲が現れる場合は、電極を次のスライスに使用できます。それ以外の場合は、電極を交換してください。最大強度投影を生成することにより、そのドメインにおけるアストロサイトの構造の詳細図が観察される。
アストロサイトにズーム倍率が4倍に達すると、1つの主要分岐、いくつかの二次分岐、および周囲の枝およびリーフレットの分布の最大強度の投影が明らかになります。ここでは、CA1アストロサイトの元の画像が示されています。アストロサイトで囲まれた細胞体、主要な枝、プロセス、および領土の体積は、これらの後続の画像で再構築されます。
再建が行われた後、相馬、細胞全体、および領土の体積を定量化した。そして、主要な支店の数が数えられました。中間アストロサイトフィラメントに標識する細胞骨格タンパク質としては、細胞ソーマ、主要分岐、およびいくつかの二次アストロサイト分岐で発現されるが、より細かい枝およびプロセスでは発現しない。
この代表的な分析では、グリアフィブリリン酸性タンパク質によって標識された一次枝の数とルシファーイエローで視覚化されるものに有意な違いは見つからなかった。また、グリアフィブリル酸性タンパク質で標識されたアストロサイトの細胞面積と体積は、ルシファーイエローで視覚化された面積および体積よりも有意に小さく、グリア細動酸性タンパク質が主要な枝を標識するための信頼できるマーカーであることを実証したが、細胞の全体的面積または体積を決定するのに有用ではない。電極先端から放出される染料の量は、色素の安定した流れを排出するのに十分な高さでなければならない電極抵抗に依存する。
今後の研究では、超分解能光顕微鏡法またはアストロサイト構造内の特定のタンパク質の発現の免疫組織化学的分析によって、アストロサイト構造の異なる成分を調べることができます。
