英語の編集を博士サイモン バートレットを感謝いたします。この調査・ デ ・ セルバンテス協会からの補助金によってサポートされたサラッド カルロス III (ISCIII) (PI14/00526;PI17/01395;CP11/00145;CPII16/00022)、ミゲル サーブレット プログラム、フンダシオン Areces;共同フォンド エウロペオ ・ デ ・開発地域 (フェダー) から資金調達。CNIC は経済省、業界競争力 (MEIC) とプロの CNIC 財団によってサポートされて、セヴェーロ オチョア Center of Excellence (SEV-2015-0505) です。RTF は、フンダシオン Areces と CNIC、ISCIII、セルバンテス de BHF で VZG によって設立された危惧地方病院 12 デ Octubre (imas12) と JMG-G ISCIII ミゲル サーブレット プログラムと imas12。

実験手順は、フンダシオン セントロ ナシオナル デによって承認された研究 Cardiovasculares カルロス III (CNIC) とスペインやヨーロッパのガイドラインに従ってコムニダード Autónoma デマドリード。マウスは特定病原体無料 (SPF) 条件で飼育し、二酸化炭素 (CO2) 吸入による安楽死されました。
1 脛骨と大腿骨からマウス骨髄細胞の分離
注: C57BL/6 コンジェニック マウスひずみ差分白血球マーカー Ptprcは野生型 C57BL 系統 CD45.2 または Ly5.2 として知られている、 Ptprcbの対立遺伝子を運ぶに対し CD45.1 または Ly5.1、として一般に認識を運ぶ。CD45.1 および CD45.2 バリアントは、抗体を用いたフローサイトメトリーによる区別できます。CD45.1/CD45.2、CD45.2, CD45.1 マウスは、フローサイトメトリーによる細胞集団の追跡を許可する養子の転送のため、細胞ソースまたは宛先として使用できます。年齢を優先的に使用- と 12 週齢以下の性別をマッチさせたのオスかメスのマウス。
<ol><li>
大腿骨と脛骨の準備
	<ol>
<li>制度上のアニマル ・ ケア委員会で承認プロトコルを使用してマウスを安楽死させます。</li>
		<li>後肢を 70% エタノールで動物の表面を噴霧して消毒します。</li>
		<li>滅菌ハサミ、鉗子やメスを使用します。メス、皮膚のカットを行うし、後の四肢を覆う皮膚を含むマウスの遠位部から皮膚を削除します。下のふくらはぎの筋肉の周りの皮膚の皮をむくし、足から皮膚を完全に削除 (図 2 a、2 b)。</li>
		<li>メスを用いた大腿骨から大腿四頭筋を分離します。股関節は、大腿骨頭を壊すことがなく disarticulate します。メス (図 2、2 D) による脛骨から筋肉を削除します。脛骨骨端を壊すことがなく、大腿骨を分離します。</li>
		<li>10% 牛胎児血清 (FBS) と冷たい 1 x ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 中 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むペトリ皿に骨をしてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞分離 メモ: 汚染を避けるため無菌素材と文化フードの下では、これ以降の手順を行う必要があります。<ol>
<li>滅菌シャーレ、メス各骨の近位および遠位端を慎重にカットします。</li>
		<li>温かみのある完全 RPMI 培地 (RPMI + 10 %fbs、2 ミリメートルの EDTA、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、20 mM HEPES、55 μ M 2-メルカプトエタノール、1 mM ピルビン酸ナトリウムと 2 mM L グルタミン) の 10 mL の容量で何度も骨をフラッシュします。1 mL の注射器に接続されている 25 G 針を使用して両端から骨をフラッシュします。</li>
		<li>70 μ m ナイロン web フィルターが装備 50 mL のコニカル チューブ、effluate に転送します。穏やかな攪拌ピペッティングして残骸と細胞集塊を慎重に外します。</li>
		<li>250 × g 10 分間室温 (RT) の細胞懸濁液を遠心します。</li>
		<li>1 mL の冷たい赤血球溶解バッファー (0.15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0.1 ミリメートルの EDTA、0.4 μ m 滅菌、フィルター選択、4 ° C で保存、1 N の HCl で 7.2 調整 pH) で細胞ペレットを再懸濁します。揺れマニュアルと氷上で 5 分間維持します。</li>
		<li>不活性化し、赤い血セル換散バッファーを洗い流すコールド バッファー (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 2 ミリメートルの EDTA + 2% ウシ血清アルブミン (BSA) x 1) 10 mL を追加します。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>完全 RPMI 培地 25 mL、250 x gで 4 ° C で 5 分間遠心すると血球を洗浄します。</li>
		<li>完全 RPMI 培地 5 mL に細胞を再懸濁します。細胞懸濁液トリパン ブルーと 1:1 のミックス 50 μ L。顕微鏡下でカウント チャンバーで細胞の数を決定します。数式を使用してセル数を計算する: 細胞/ml = [(非染色細胞数/4) 2 x 10,000 x]12。 注: このメソッドの利回り 40 x 106 60 x 106骨骨髄細胞 12 週齢の c57bl/6 マウスに感染していない 8 あたり。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DC 分化、成熟および抗原読み込み
<ol><li>
BM の細胞採取
	<ol>
<li>ウェルあたり 5 mL で通常、中の mL あたり 10 の6セルで 6 も超低付着表面板の完全な文化をシードします。分化したマクロファージは、培養皿にアタッチされます。12 h 後 6 ウェル プレート、付着のマクロファージで古い 6 ウェル プレートを破棄することをきれいにする、単球は主に培養上清を転送します。</li>
		<li>20 ng/mL 37 ° C、5% 二酸化炭素 (CO2) で遺伝子組換えマウス GM-CSF を商業的取得を含む完全 RPMI 培地の井戸あたり通常 5 mL の mL あたり 5 x 10 の5セルで非付着細胞の培養細胞の分化を促進して毎日を観察します。</li>
		<li>3 日ごと浮遊細胞スピンダウンし 5 mM PBS で EDTA と付着性のセルを収集し、スピン ・ ダウン。組み合わせるし、5 x 105セル/20 ng/mL rm-GM-CSF を含む新鮮な培地で mL で再懸濁します。</li>
		<li>8 日上記と付着性と戸建の細胞を収集し、非培養処理滅菌シャーレ、高 MHC-II を誘導するために 24 時間を 5 × 105セル/mL 中含む 20 ng/mL に GM-CSF と 20 ng/mL リポ多糖 (LPS) で再懸濁します、CD80 および CD86 の発現。</li>
		<li>2.2 の手順で示されているようにフローサイトメトリーによるチェック DC 分化。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
流れの Cytometry の分化と成熟分析。
	<ol>
<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>マウス Fc 受容体拮抗薬 (抗マウス IgG CD16/CD322b抗体精製) 製造元の指示に従って 4 ° C で 15 分間で再懸濁細胞ペレットの孵化によってブロック Fc 受容体。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>各プローブの 4 ° C で流れ cytometry バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 300 μ L で 250,000 の細胞を再懸濁します。</li>
		<li>96 ウェル プレートに 30 μ L/ウェルの細胞液を転送します。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、抗体を含む 30 μ L を追加各メーカーの指示を次もバッファー。4 ° C で 20 分のための抗体を持つ細胞をインキュベートします。 注: は、Dc、単球、マクロファージ、CD11b、CD64、CD115、CD11c、動的、CD80、CD86 通常マーカーを採用 (図 3)。</li>
		<li>250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、死んだ細胞 (propidium ヨウ化など, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) またはアミン反応性色素を除外するマーカーを含む冷たい流れ cytometry バッファーの井戸あたり 200 μ L で再懸濁します) 製造元の推奨濃度13。</li>
		<li>0、3、6、9 の日に死んだ細胞を除く流動フローサイトメトリー解析を行うことで、流れの cytometry のチューブにサンプルを転送する細胞分化を監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DC 抗原負荷。
	<ol>
<li>8 日に 250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 中でペレットを再懸濁します (RPMI + 10 %fbs 抗生物質なし)。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>10 μ G/ml OVAp (323-339; と Dc を孵化させなさいISQAVHAAHAEINEAGR) 1 x 107 1 mL 中の Dc あたり (RMPI + 1 %fbs) 37 ° C で少なくとも 30 分のプラスチック製のチューブで陰性対照条件として Dc の非 OVAp ロードを使用します。</li>
		<li>250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 完全 RPMI 培地でペレットを再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
		<li>250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、200 μ L 中でペレットを再懸濁します (RPMI + 10 %fbs) 2 x 106セル/mL で。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. OTII マウスからナイーブ cd4 陽性 T 細胞の分離
注: このメソッドは、12 週齢の c57bl/6 マウスに感染していない 8 あたり約 100 × 106脾臓細胞を生成します。男性と女性の両方を使用できます。CD4 T 細胞は脾臓やリンパ節から分離することができます。CD4 T 細胞はそれぞれ約 25% とこれらの器官の細胞の 50% を占めています。無菌状態で次の手順を実行します。
<ol><li>鼠径部、腋窩、上腕、頚部、および腸間膜のリンパ節および脾臓 OTII トランスジェニック マウス (図 4) から分離し、プラスチック シャーレ完全 RPMI 培地 10 ml に転送。</li>
	<li>完全 RPMI 培地 2 mL でセル ストレーナーを洗浄、50 mL のチューブから取り外します。転送リンパ節および脾臓に 70 μ m の細胞ストレーナーは、50 mL のチューブに配置。シリンジのプランジャー (図 5) を使用して均質化し、媒体を追加 15 mL まで。</li>
	<li>250 x g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心し、完全 RPMI 培地 15 mL にペレットを再懸濁します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>脾臓細胞懸濁液、細胞ペレットを再懸濁します、1.2.5 の手順で示されているように、赤の血液細胞を溶解します。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 250 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。</li>
	<li>完全 RPMI 培地 25 mL、250 x gで室温 5 分間遠心すると血球を洗浄します。</li>
	<li>5 mL の培地で細胞を再懸濁します。トリパン ブルーと 1:1 の細胞懸濁液を 50 μ l 添加をミックスします。顕微鏡下でカウント チャンバーを用いた細胞の数を決定します。数式を使用してセル数を計算する: 細胞/ml = [(非染色細胞数/4) 2 x 10,000 x]12。</li>
	<li>2.2.2 手順を繰り返します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、1:800 CD8α、IgM、B220、CD19、MHCII (私 Ab)、CD11b、CD11c、CD44、CD25、DX5 CD4 T 細胞の後で否定的な選択のための氷の上で 30 分間ビオチン化抗体の希釈でセルをインキュベートします。</li>
	<li>製造元の指示に従って、セルの数と、ビーズの容量に基づいて、マイクロ磁気ビーズのストレプトアビジン コーティングの必要量を計算磁気セル区切り記号および適切な cd4 陽性 T 細胞を分離分離カラム。</li>
	<li>完全 RPMI 培地 5 mL に細胞を再懸濁します、3.7 の手順で説明されているように生きているセルをカウントしながら氷の上にそれらを保ちます。</li>
	<li>2 x 10 の5セルを抽出し、メーカー推奨の抗体希釈液を使用して流れの cytometer で蛍光抗体を使用して抗 CD8 B220、CD3、CD4 収集した細胞の純度を確認してください。</li>
	<li>分離ナイーブ CD4/OTII T 細胞を染色するには、500 μ L バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 10 の6セルを再懸濁します。500 を準備重要な細胞トレーサー染料の最終的なメーカー推奨濃度をダブル μ L バッファー (PBS、2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa × 1) を含みます。ゆっくりと細胞懸濁液に細胞トレーサーのソリューションを追加することによって、両方のソリューションをミックスします。37 ° C で 5 分間細胞をインキュベートします。</li>
	<li>完全 RPMI 培地 5 mL、250 x g で 4 ° C で 5 分間遠心するとセルを洗浄してこの手順を 2 回繰り返します。1 x 107セル/mL で完全 RPMI 培地 1 mL の細胞を再懸濁します。</li>
</ol>4.生体内で活性化、増殖と th1 細胞分化アッセイ
注: 重要な細胞トレーサー染料 carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) ・その他染色エステル ベースの染料、興奮している、異なる波長の蛍光を発する活躍してリンパ球増殖を評価する流れで高い蛍光強度、長寿命、変動の少ない、低毒性14などフローサイトメトリー。
<ol><li>本静脈内 (静注) 1 x 106ライブの重要な細胞トレーサー染料染色ナイーブ CD4/OTII T 細胞マウスあたり 100 μ L の PBS を転送します。尾静脈またはレトロ軌道注入15; によってラベル付けされた T 細胞、に対して転送できます。両方のケースでの家では、細胞、リンパ器官 (図 6 a)。</li>
	<li>受信者のマウス 1 日後によって挑戦に対して皮下注射 (点火) (図 6 b) で 100,000 LPS 成熟 OVAp ロード DCs を転送します。</li>
	<li>受信者マウス膝窩リンパ節の収穫、3.1 と 3.2 で前述したように同じ手順に従って単一細胞懸濁液の入手まで処理します。予防接種 2 日後 CD4/OTII T 細胞の活性化を測定して増殖と th1 細胞分化を測定する 5 日目には、これを行います。</li>
	<li>2 日目の T 細胞活性化を分析する CD69 CD4, CD25 蛍光抗体と細胞を染色 (必要に応じて CD45.1 および CD45.2) C69 の割合を決定して+CD25+ T 細胞の CD4 人口。フローサイトメトリー (図 7) を分析します。</li>
	<li>5 日目に T 細胞の増殖を確認するには、CD4 と必要に応じて CD45.1 および CD45.2 に対する適切な蛍光抗体を用いて細胞を染色します。フローサイトメトリー (図 8) による CD4 人口の重要な細胞トレーサー染料信号の減衰を分析します。これらの研究は、重要な細胞トレーサー染料、各蛍光ピークの分裂細胞の割合、総細胞の分裂細胞の割合で標識細胞が細胞分裂の数などのいくつかのパラメーターを確認できます。人口。</li>
	<li>/1 μ M イオノマイシンと 10 ng/mL 12 13 フォルボールエステル (PMA) のインキュベーター内の 37 ° C で 6 時間を含む完全 RPMI 培地を 200 μ l 添加の 96 ウェル プレートのウェル プレート 400,000 セル、5 日目で th1 細胞分化を決定します。最後の 4 h 3-10 μ G/ml ブレフェルジン A 媒体にサイトカイン分泌をブロックするを追加します。</li>
	<li>遠心分離機の 4 ° C で 250 x gで 5 分間プレート96 ウェル プレートの急速な反転で上澄みを廃棄します。</li>
	<li>2.2.2 手順を繰り返します。</li>
	<li>メーカー推奨希釈液に含まれている抗体 CD4、必要に応じて CD45.1 および CD45.2 をバッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 30 μ L で 4 ° C で 15 分間インキュベートし、細胞膜を染色します。バッファー (1 × PBS + 2 ミリメートルの EDTA + 2 %bsa) の 150 μ L を追加することによって、細胞を洗浄し、遠心分離機の 4 ° C で 250 x gで 5 分間プレート上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1,000 x gで 5 分間、4 ° C の板した遠心分離機で 20 分間 2 %paraformaldehyde/1% ショ糖の 100 μ L を追加することでセルを修復します。上清を捨てます。</li>
	<li>細胞内透過バッファー (1 × PBS + 0.01 M HEPES、0.3% サポニン 0.1 %bsa) の 50 μ L を追加することによって、セルを permeabilize し、4 ° C で 30 分間インキュベート</li>
	<li>破棄した上清に 1,000 x gで 150 μ L の PBS と 5 分間遠心を追加します。</li>
	<li>バッファー (PBS + 0.1% サポニン) で抗肝腎抗体蛍光体共役の 30 μ L を追加することによって細胞内サイトカインを汚し、室温 30 分間インキュベート</li>
	<li>バッファー (PBS + 0.1% サポニン) の 150 μ L を追加することによって、細胞を洗浄します。RT で 1,000 x gで 5 分間プレートを遠心し、上澄みを廃棄します。この手順を 2 回繰り返します。</li>
	<li>(図 8) フローサイトメトリーによる細胞集団を分析します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+effector+CD4+T+cell+populations+(*).">Differentiation of effector CD4 T cell populations (*).</a> Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).</li><li>Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+Lymphocyte+Polarity+in+Cognate+Immune+Cell-Cell+Interactions.">Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).</li><li>Gonzalez-Granado, J. 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このプロトコルは、BM から派生した Dc の活性化・増殖・ ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の分化を調節する能力の評価を使用できます。また、BM から派生した Dc によって変調する CD4 T 細胞の感受性を評価するために使用もできます。このプロトコルで測定された生体内でこれらのイベントの変更ができます。
調査中の仮説によって T 細胞と DCs のいくつかの組み合わせを...

CD4 T 細胞と抗原提示細胞 (APCs) Dc などは、微生物病原体1,2に免疫の必要なメディエーターです。末梢のリンパ組織における CD4 T 細胞は Apc3,4,5によって提示された特定の抗原の認識に基づいてアクティブ化されます。活性化 cd4 陽性 T 細胞は、増殖し、正しい適応免疫応答6、7の開発に必要な個別の特定エフェクター Th 細胞に分化します。これらのプロセスの制御は、有害な組織損傷8を生成せず、病原体を殺す十分な適応性の防衛を生産するため重要です。Th 細胞は式または表面分子、転写因子やエフェクター サイトカインの生産によると定義され、病原体1への応答で不可欠な機能を実行します。Th1 細胞サブセットの細胞は、転写因子 t-bet とサイトカイン インターフェロン γ (肝腎) を表現、1細胞内の病原体に対する生体防御に参加します。ナイーブな cd4 陽性 T 細胞の活性化・増殖・ th1 細胞分化の定量化は、免疫応答における役割 T 細胞再生を評価するための有用な手段です。
このプロトコルによりin vivo解析で体外の容量には、活性化・増殖・ ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の th1 細胞の分化を調節するための Dc の BM の派生が生成されます。プロトコルもナイーブ cd4 陽性 T 細胞活性化、増殖誘導の能力を評価して th1 細胞分化 (図 1)。この汎用性の高いプロトコルは、具体的操作またはプロトコル純粋な生体内での研究セル人口を選択できないことを回避できます。多様な分子と Dc の治療の影響は、治療または分離 BM セル9を遺伝子操作、遺伝子改変マウス5から BM を使用して学ぶことができます。同様に、養子の転送のための T 細胞の異なるソースからまたはいくつかの操作3,8,10後取得することによって T 細胞の反応を探索できます。
このプロトコルの主な利点は 2 つあります。T 細胞の活性化・増殖・ th1 細胞分化を流れの cytometry アプローチ; 分析します。これが生体内で研究、体外で発生する変更を回避したがってと細胞のタイプとだけそのまま臓器11に見られるその他の要因などを含むと組み合わされています。
重要な染料の使用は、放射能の使用を回避しながら増殖を追跡するため広く使用されている手法です。これらの試薬と拡散の測定は、細胞分裂後色素希釈法に基づいています。また、これらの染料は、複数の波長で検出することができます、複数の蛍光抗体またはマーカーと組み合わせてフローサイトメトリーによる分析が簡単に。Th1 細胞分化、増殖、活性化 T 細胞をフローサイトメトリーによる分析する方法を示すことによってこのプロトコルの有用性を強調表示します。

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20,824,365</td><td>5 L</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>10020-00</td><td>Box of 100 blades</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SIGMA</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>GIBCO</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>Novico</td><td>N15663</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m nylon web filter</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Red blood lysis buffer</td><td>SIGMA</td><td>R7757</td><td>100 Ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>ED2SS-250</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>SIGMA</td><td>302643-25G</td><td></td></tr><tr><td>Culture-plates</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Cambrex</td><td>BE17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>8-05740-0250</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>LONZA</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>LONZA</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)</td><td>Prepotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>lipopolysaccharide (LPS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L2018</td><td></td></tr><tr><td>96-well-plate</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>v450 anti-mouse CD11b antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>560455</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD64 antibody</td><td>BioLegend</td><td>139303</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD115 antibody</td><td>BioLegend</td><td>135505</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td><td>BioLegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse MHCII antibody</td><td>BioLegend</td><td>125507</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD86 antibody</td><td>BioLegend</td><td>105011</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD80 antibody</td><td>BioLegend</td><td>104713</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometry tubes</td><td>Zelian</td><td>300800-1</td><td>PS 12X75 5mL</td></tr><tr><td>OTII Ovoalbumine peptide</td><td>InvivoGen</td><td>323-339</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD8&amp;alpha; antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated IgM antibody</td><td>BioLegend</td><td>406503</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated B220 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0452-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD19 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0193-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody</td><td>BioLegend</td><td>115302</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD11b antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0112-U500</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD11c antibody</td><td>BioLegend</td><td>117303</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD44 antibody</td><td>BioLegend</td><td>103003</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated CD25 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse biotinylated DX5 antibody</td><td>BioLegend</td><td>108903</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-coated magnetic microbeads</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic cell separator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>QuadroMACS Separator</td></tr><tr><td>Separation columns</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD4 antibody</td><td>BioLegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD3 antibody</td><td>BioLegend</td><td>100235</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD8 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Cell Violet Tracer</td><td>Thermofisher</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD25 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 anti-mouse CD69 antibody</td><td>BioLegend</td><td>104518</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>65-0453</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD45.1 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0453</td><td></td></tr><tr><td>PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>60-0453</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD45.2 antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0454</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA)</td><td>SIGMA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td><td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Millipore</td><td>8-18715-02100</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular permeabilization buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-8333</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse IFNg antibody</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-7311-U100</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (anti-mouse CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-U100</td><td></td></tr><tr><td>B6.SJL CD45.1 mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&amp;trade; Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Solution</td><td>Thermofisher</td><td>62248</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vivo mouse model to measure na&#239;ve cd4 t cell activation, proliferation and th1 differentiation induced by bone marrow-derived dendritic cells

ナイーブな cd4 陽性 T 細胞の活性化・増殖・ T ヘルパー 1 への分化の定量化 (Th1) 細胞は免疫応答における T 細胞の役割を評価するために便利な方法です。このプロトコルでは、顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子 (GM-CSF) の由来樹状細胞 (Dc) を取得する (BM) 骨髄前駆細胞の in vitro分化について説明します。プロトコルはまた卵白ペプチド (OVAp) の養子の転送を記述-GM 由来 CSF Dc とナイーブ cd4 陽性 T 細胞を生体内で活性化・増殖・ th1 細胞分化を解析するために OTII トランスジェニック マウスからロード、転送 CD4 T 細胞。このプロトコルは、純粋な生体内での方法の具体的操作または調査のセル人口を選択する無力によって課される制限を回避できます。さらに、このプロトコルは生体外で発生する可能性があります機能の要因など細胞の種類とそのまま臓器でのみ発見その他の要因の影響の変化を避けるため生体内の環境で研究をできます。Dc の変更を生成するための便利なツールであり、T 細胞をプロトコル適応免疫応答、潜在的起源や多数の免疫関連疾患の開発を理解するための重要な結果を提供することを変更します。

図 1は、このプロトコルで説明されている手順を示しています。図 2は、マウスの骨髄細胞の培養と分離を示しています。これらの文化に GM-CSF と LP の追加により、体外生成と dc図 3の成熟分化の流れのフローサイトメトリー解析と取得した dc OVAp ロード GM-CSF BM から派生した Dc の成熟を示して?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vivo Mouse Model to Measure NaÃ¯ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells at JoVE

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T 細胞の養子移動について説明します。

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

an-vivo-mouse-model-to-measure-nave-cd4-t-cell-activation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.4K ビュー.  Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC). 今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T 細胞の養子移動について説明します。

ビデオ: An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

免疫・感染学

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

生物学

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

医学

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

<meta charset="utf8"></head><body>フローサイトメトリーを用いたナイーブCD4+ T細胞からのTh17細胞分化

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:サイトカイン濃度調節を用いたTh17細胞の高純度In vitro分化の達成

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

マウスにおけるナイーブCD4+ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

メジャーナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウスモデル

要約

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この動画の章

B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

移植片対宿主病の誘導および

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

マウスナイーブCD4

腫瘍特異的 CD8⁺ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

開発とマウス免疫寛容樹状細胞の機能解析

マウスから骨髄由来樹状細胞を単離および培養するための経済的かつ効率的なプロトコル

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

マウスにおけるナイーブCD4⁺ T細胞の病原性Th17細胞へのin vitro分化

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

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B細胞のCD40 -活性化のモデルマウス

移植片対宿主病の誘導および

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

2光子イメージングで使用するための骨髄由来マウス樹状細胞の世代

マウスナイーブCD4

腫瘍特異的 CD8+ T 細胞応答における Immunodominance を研究するためのインビボ細胞毒性アッセイ

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