この方法は、脂質膜を有するタンパク質の方向を研究するのに役立ちます.我々の場合、負に荷電したリン脂質に対するアネキシンのカルシウム依存的結合を分析するために使用する。この手法の主な利点は、ラベルフリー、センシティブ、定量的、および相互作用がリアルタイムで観察できることです。
したがって、実際の結果の直接分析を可能にします。この技術は、より複雑なマイクロ分子集合体または細胞の相互作用などの他のシステムにも適用できる。テキストプロトコルに記載されているように、明確な5ミリモル脂質溶液を使用してください。
溶解した脂質を、10ミリリットルのガラスチューブで所望のモル比に組み合わせます。窒素の乾燥した流れを使用して有機溶媒を蒸発させます。脂質混合物を高真空凍結乾燥システムに3時間放置し、残存痕跡を除去します。
さて、クエン酸緩衝液の1ミリリットルに脂質膜を再懸濁する。水浴で30分間摂氏60度で脂質懸濁液をインキュベートし、5分ごとに激しく渦を出します。この温度は、混合物中で最も高い融解脂質の相転移温度を約10°C上回る。
一方、50ナノメートル径の細孔サイズのポリカーボネート膜を30分間過渡温度で装備した押出機を予熱する。マルチラメラ小胞懸濁液を予熱押出機に積み込みます。ポリカーボネート膜を通して31回そっと通過し、小さなユニラメラ小胞またはSUVを形成します。
温度を転移温度より上に保ちます。SUVサスペンションを2ミリリットルのプラスチック反応容器に移し、クエン酸バッファを追加して最終容積を2ミリリットルにします。2%SDS溶液に4つのセンサーを2%SDS溶液に挿入して、少なくとも30分間インキュベートします。
その後、SDSを完全に除去するために、超純水でそれらを広範囲に洗浄し、乾燥アルゴンまたは窒素の流れを使用してそれらを試してみてください。プラズマ洗浄システムを使用して、汚染物質を完全に除去します。そのためには、プラズマ洗浄室にドライセンサーを挿入し、チャンバーを退出し、酸素で3回洗い流します。
次に、プラズマクリーナーの電源を入れます。真空、高周波電力、および10分の処理時間を使用します。クリーニングの実行後、機械の電源を切り、センサーを取り出します。
ピンセットを使用して、プラズマクリーニングされたセンサーを4つのフローチャンバーに慎重にドッキングします。漏れの原因となるチャンバーやチューブの圧力や引き下げは避けてください。オープンフローモードでクエン酸バッファを使用してシステムを10分間フラッシュします。
プログラムを起動します。周波数と散逸ベースラインが安定するまで、ソフトウェアを使用して、最初の基本的なトーンと倍音の周波数と散逸の周波数と散逸の変化を記録し始めます。ベースラインが安定したら、クエン酸バッファにSUVサスペンションを適用します。
反応容器を使用して、1.5ミリリットルのデッドボリュームを取り除き、ループフローモードでシステムを閉じます。さらに 10 分間、周波数の散逸シフトを記録します。SLBが安定している場合、オープンフローモードで必要なカルシウム濃度のランニングバッファを40分間平衡化します。
カルシウムを含む実行中のバッファにタンパク質を加えます。平衡定常状態になるまでループフローモードでタンパク質の適用を行う。さて、オープンフローモードでランニングバッファ内にカルシウムイオンを5ミリモルEGTAでキレートすることにより、結合タンパク質を解約する。
連続的な開いた流れモードで二重蒸留水の50ミリリットルでマイクロバランスシステムを再生します。水容器からチューブを取り出し、システムを乾燥させます。慎重に結晶センサーを取り外し、ポリテトラフルオロエチレンホルダーを使用して2%SDS溶液で洗浄してください。
センサーが配置されたフローモジュール内部の可視部分を乾燥させます。ここに示す、周波数曲線と散逸シフトの記録である。リポソームの添加時の周波数の顕著な低下は、バッファー充填小胞が剛性ではなく粘弾性であるので、その吸収を示し、散逸が増加する。
その後、合体小胞が破裂する。小胞内部のバッファーの付随放出は、安定した高原に達するまで吸着質量を減少させる。脂質へのアネキシンA2の結合は、明確な周波数シフトによって見られるように質量を追加するが、放散のわずかな変化によって示されるように二重層構造を妨げない。
キレート剤によってカルシウムイオンが除去されると、EGTA、アネキシンA2は脂質膜から解離する。周波数と散逸記録は、アネキシンA2結合がカルシウムイオンに完全に依存し、脂質膜がそのまま残っていることを示す二重層で見られるレベルにシフトします。代表的な陰性制御実験をここに示す。
ホスファチジルセリンが存在しない場合、カルシウムイオンの存在下でアネキシンA2を添加した後、頻度または散逸の変化は明らかでない。この手順を試みる間、適切な二重層形成を確保することが重要です。すぐにリポソームを使用し、そうでなければ小さな小胞は不安定なベースラインにつながる可能性があり、より少ない表面張力を持つより大きなものに融合します。
この手順に従って、膜タンパク質相互作用の定量的記述を行い、協力的結合と非協力的結合のような追加の質問に答えることができます。
