שיטה זו יכולה לעזור ללמוד כיוונים של חלבונים עם קרום השומנים. במקרה שלנו, השתמש בו כדי לנתח את הכריכה תלוית הסידן של נספחים לפוספוליפידים טעונים שלילית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שזה תווית חינם, רגיש, כמותי, כי אינטראקציות ניתן לראות בזמן אמת.
ובכך מאפשר ניתוח ישיר של תוצאות אמיתיות. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות אחרות, כגון האינטראקציה של הרכבות micromolecule מורכבות יותר או אפילו תאים. השתמש ברור חמישה פתרונות השומנים מילימולר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
ערבבו את השומנים המומסים ביחס התבונה הרצוי בצינורות זכוכית 10 מיליליטר. להתאדות את הממסים האורגניים באמצעות זרם יבש של חנקן. השאירו את תערובת השומנים על מערכת ליופיליזציה ואקום גבוהה במשך שלוש שעות כדי להסיר את כל עקבות שיורית של הממסים.
עכשיו, תן שימוש חוזר בסרט השומנים במיליליטר אחד של חיץ ציטראט. דגירה השעיית השומנים ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים, מערבולת אותו במרץ כל חמש דקות. טמפרטורה זו היא סביב 10 מעלות צלזיוס מעל טמפרטורת מעבר הפאזה של השומן הנמס הגבוה ביותר בתערובת.
בינתיים, מחממים את extruder מצויד קרום פוליקרבונט נקבובית בקוטר 50 ננומטר מעל טמפרטורת המעבר במשך 30 דקות. טען את ההשעיה שלפוחית multilamellar לתוך extruder שחומם מראש. מעבירים בעדינות את התערובת 31 פעמים דרך קרום הפוליקרבונט כדי ליצור וריקלים חד-קרקעיים קטנים או רכבי שטח.
שמור על הטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר. מעבירים את ההשעיה SUV לכלי תגובה פלסטיק שני מיליליטר ולהוסיף את מאגר ציטראט להביא את הנפח הסופי לשני מיליליטר. הדגירה ארבעה חיישנים מוכנס מחזיק polytetrafluoroethylene בתת פתרון 2%SDS לפחות 30 דקות.
ואז לשטוף אותם בהרחבה עם מים טהורים במיוחד כדי להסיר לחלוטין את SDS ולנסות אותם באמצעות זרם של ארגון יבש או חנקן. השתמש במערכת ניקוי פלזמה כדי להסיר לחלוטין את כל מזהמים. כדי לעשות זאת, להכניס את החיישנים היבשים בתא ניקוי הפלזמה, לפנות את התא, ולשטוף אותו שלוש פעמים עם חמצן.
לאחר מכן, הפעל את מנקה הפלזמה. השתמש בוואקום, בעוצמת תדר רדיו גבוהה וב-10 דקות של זמן תהליך. לאחר הפעלת הניקוי, כבה את המכונה וה להוציא את החיישנים.
עגן בזהירות את חיישני ניקוי הפלזמה לארבעת תאי הזרימה באמצעות פינצטה. הימנע מכל לחץ או פיתיון של התאים והצינורות שעלולים לגרום לדליפה. רוקן את המערכת עם מאגר ציטראט במצב זרימה פתוח למשך 10 דקות.
הפעל את התוכנית. התחל להקליט שינויים בתדירות ובפיזור של הטון הבסיסי הראשון וגווני-על המשתמשים בתוכנה עד שתוכניות הבסיס של התדר והפיזור יהיה יציב. כאשר קווי הבסיס יציבים, החל את המתלה SUV במאגר ציטראט.
באמצעות כלי תגובה, להסיר 1.5 מיליליטר של נפח מת, ולאחר מכן לסגור את המערכת במצב זרימת לולאה. הקלט את משמרת פיזור התדרים למשך 10 דקות נוספות. כאשר ה- SLB יציב, יש לצייד את המערכת במאגר פועל בריכוזי הסידן הנדרשים במצב זרימה פתוח למשך 40 דקות.
מוסיפים את החלבון למאגר הריצה המכיל סידן. בצע את היישום של החלבון במצב זרימת לולאה עד שיווי משקל יציב מגיע. עכשיו, נתק את החלבון המאוגד על ידי כלאט יוני סידן עם EGTA חמישה מילימולרים במאגר פועל במצב זרימה פתוחה.
מחדש את מערכת המיקרו-איזון עם 50 מיליליטר של מים מזוקקים כפולים במצב זרימה פתוח רציף. מוציאים את הצינורות ממכל המים ונותנים למערכת להתייבש. הסר בזהירות את חיישן הגביש ונקה אותו באמצעות תספור SDS 2% באמצעות מחזיק הפוליטטרא-פלואורואתילן.
יבש את החלקים הנראים לעין של פנים מודול הזרימה שבו החיישן הוצב. מוצג כאן, הוא ההקלטה של עקומת התדרים ותזוזות פיזור. הירידה הבולטת בתדירות עם תוספת של ליפוזומים, מציין את ספיגתם כי החיץ מלא ורידים אינם נוקשים אבל ויסקולסטי, התפוגגות עולה.
לאחר מכן, וריקוסים מתמזגים להיקרע. שחרור בו-זמני של החיץ בתוך הווסיקלים מקטין את המסה הסוחף עד להגיע לרמה יציבה. הכריכה של Annexin A2 לשומנים מוסיפה מסה כפי שניתן לראות על ידי שינוי התדר הברור, אך אינה מפריעה למבנה bilayer כפי שצוין על ידי השינוי הקטן היחיד בהתפוגגות.
כאשר סידן יון מוסר על ידי סוכן chelating, EGTA, Annexin A2 ניתוב מהסרט השומנים. התדירות והקלטות ההתפוגגות עוברות לרמות שנראו עם הביליאר רק מצביעות על כך שקשירת Annexin A2 תלויה לחלוטין ביון הסידן ושסרט השומנים נותר שלם. ניסוי שליטה שלילי ייצוגי מוצג כאן.
כאשר פוספטידילסרין נעדר, אין שינויים בתדירות או פיזור ניכרים לאחר הוספת Annexin A2 בנוכחות יון הסידן. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להבטיח היווצרות bilayer נאותה. השתמש ליפוזומים מיד, אחרת יבלות קטנות יתמזגו לתוך גדולים יותר עם פחות מתח פני השטח שיכול להוביל לקו בסיס לא יציב.
בעקבות הליך זה, תיאור מכמת של אינטראקציה חלבון קרום יכול להתבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שיתוף פעולה לעומת כריכה לא שיתופית.
