Questo metodo può aiutare a studiare le direzioni delle proteine con membrane lipidiche. Nel nostro caso, usalo per analizzare il legame dipendente dal calcio delle annessine ai fosfolipidi caricati negativamente. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è priva di etichette, sensibile, quantitativa e che le interazioni possono essere osservate in tempo reale.
Consentendo così l'analisi diretta dei risultati reali. Questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi, come l'interazione di gruppi di micromolecole più complessi o persino di cellule. Utilizzare cinque soluzioni lipidiche millimolari chiare come descritto nel protocollo di testo.
Unire i lipidi disciolti nel rapporto molare desiderato in tubi di vetro da 10 millilitri. Evaporare i solventi organici utilizzando un flusso secco di azoto. Lasciare la miscela lipidica su un sistema di lofilizzazione ad alto vuoto per tre ore per rimuovere eventuali tracce residue dei solventi.
Ora, rimospendare il film lipidico in un millilitro di tampone di citrato. Incubare la sospensione lipidica a 60 gradi Celsius per 30 minuti in un bagno d'acqua, vortice vigorosamente ogni cinque minuti. Questa temperatura è di circa 10 gradi Celsius sopra la temperatura di transizione di fase del lipide fuso più alto nella miscela.
Nel frattempo, preriscaldare l'estrusore dotato di una membrana in policarbonato delle dimensioni di un poro di 50 nanometri di diametro superiore alla temperatura di transizione per 30 minuti. Caricare la sospensione vescicolare multilamellare nell'estrusore preriscaldato. Passare delicatamente la miscela 31 volte attraverso la membrana in policarbonato per formare piccole vescicole unilamellari o SUV.
Mantenere la temperatura al di sopra della temperatura di transizione. Trasferire la sospensione del SUV su un recipiente di reazione in plastica da due millilitri e aggiungere il tampone di citrato per portare il volume finale a due millilitri. Incubare quattro sensori inseriti in un supporto in politetrafluoroetilene in una soluzione 2%SDS per almeno 30 minuti.
Quindi lavarli ampiamente con acqua ultra pura per rimuovere completamente l'SDS e provarli usando un flusso di argon secco o azoto. Utilizzare un sistema di pulizia del plasma per rimuovere completamente eventuali contaminanti. Per fare ciò, inserire i sensori asciutti nella camera di pulizia del plasma, evacuare la camera e scaricarla tre volte con ossigeno.
Quindi, accendi il pulitore al plasma. Utilizzare il vuoto, l'alta potenza a radiofrequenza e 10 minuti di tempo di processo. Dopo la pulizia, spegnere la macchina ed espulse i sensori.
Agganciare con cura i sensori puliti al plasma nelle quattro camere di flusso utilizzando una pinzetta. Evitare qualsiasi pressione o torsione delle camere e dei tubi che possa causare perdite. Sciacquare il sistema con buffer di citrato in modalità di flusso aperto per 10 minuti.
Avvia il programma. Inizia a registrare eventuali cambiamenti nella frequenza e nella dissipazione del primo tono fondamentale e delle sfumature utilizzando il software fino a quando le linee di base di frequenza e dissipazione non sono stabili. Quando le linee di base sono stabili, applicare le sospensioni SUV nel buffer citrato.
Utilizzando un recipiente di reazione, rimuovere 1,5 millilitri del volume morto, quindi chiudere il sistema in modalità flusso loop. Registrare lo spostamento di dissipazione della frequenza per altri 10 minuti. Quando l'SLB è stabile, equilibrare il sistema con un tampone di corsa alle concentrazioni di calcio richieste in modalità di flusso aperto per 40 minuti.
Aggiungere la proteina al tampone di corsa contenente calcio. Eseguire l'applicazione della proteina in modalità flusso ad anello fino a raggiungere uno stato stazionario di equilibrio. Ora, dissociare la proteina legata imbrogliando gli ioni di calcio con cinque millimolari EGTA nel tampone di corsa in modalità a flusso aperto.
Rigenerare il sistema di microbilanciamento con 50 millilitri di acqua distillata doppia in modalità a flusso aperto continuo. Rimuovere i tubi dal contenitore dell'acqua e lasciare asciugare il sistema. Rimuovere con cura il sensore di cristallo e pulirlo con una soluzione 2%SDS utilizzando il supporto in politetrafluoroetilene.
Asciugare le parti visibili dell'interno del modulo di flusso in cui è stato posizionato il sensore. Qui è mostrata la registrazione della curva di frequenza e degli spostamenti di dissipazione. Il calo prominente della frequenza dopo l'aggiunta dei liposomi, indica il loro assorbimento perché le vescicole riempite di tampone non sono rigide ma viscoelastiche, la dissipazione aumenta.
Successivamente, le vescicole coalesci si rompono. Il rilascio concomitante del tampone all'interno delle vescicole diminuisce la massa adsorbita fino a raggiungere un altopiano stabile. Il legame dell'allegato A2 ai lipidi aggiunge massa come visto dallo spostamento di frequenza chiaro, ma non interferisce con la struttura bistrato come indicato dall'unico piccolo cambiamento nella dissipazione.
Quando lo ione calcio viene rimosso dall'agente chelatore, EGTA, l'annesso A2 si dissocia dal film lipidico. La frequenza e le registrazioni di dissipazione si spostano ai livelli osservati con il bistrato che indica solo che il legame annexin A2 dipende totalmente dallo ione calcio e che il film lipidico rimane intatto. Qui viene mostrato un esperimento rappresentativo di controllo negativo.
Quando la fosfatidilserina è assente, non si manifestano variazioni di frequenza o dissipazione dopo l'aggiunta dell'allegato A2 in presenza dello ione calcio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante garantire una corretta formazione dei duestrati. Usa immediatamente i liposomi, altrimenti le piccole vescicole si fonderanno in quelle più grandi con meno tensione superficiale che può portare a una linea di base instabile.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire una descrizione quantica di un'interazione proteica di membrana al fine di rispondere a domande aggiuntive come il legame cooperativo rispetto a quello non cooperativo.
