この方法は、アルツハイマー病研究の分野で重要な質問に答えることができます, 特に成長コーン崩壊に関与する初期のイベント.この技術の主な利点は、アミロイドベータ治療の直後に軸索成長コーンを可視化し、分析することを可能にすることです。抗生物質を含まないニューロン培養培地で、マイクロハサミを使用して、胚性14日目マウスから新たに単離された大脳皮質をミンチすることから始めます。
組織を収集し、3分間87Gで組織を遠心分離します。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットに0.05%トリプシンの2ミリリットルを加えます。摂氏37度で15分間インキュベートし、5分ごとにタップして混ぜます。
15分後、トリプシンを中和するために4ミリリットルのミディアムAを加え、タップして混ぜます。その後、組織を178倍Gで3分間遠心分離する。上清を取り除いた後、DNAseと大豆トリプシン阻害剤溶液を加え、前のように5分ごとに混合して摂氏37度で15分間インキュベートします。
インキュベーション時間が経過したら、以前のように4ミリリットルの培地A.Mixと遠心分離機を加えます。上清を取り除いた後、4ミリリットルの培地Aを加え、磨かれたパスツールピペットで組織をトリチュレートして、破片が見られないまで行います。次に、70ミクロンの細孔サイズのメッシュで三角組織をフィルター処理します。
濾過後、ヘモサイトメーターで細胞を数え、細胞密度を計算します。ピペット0.8倍10〜培地Aの4番目の細胞を8ウェル培養スライドの各ウェルに入れた。その後、摂氏37度で10%CO2の加湿雰囲気でインキュベートします。
4時間の培養後、培養培地を培地Bに変更し、この方法を用いたニューロンの純度は、市販の全長Aベータ42の新鮮なバイアルを開き、その内容物を無菌で溶解して、0.5ミリモルの濃度に溶解することにより、少なくとも1週間前にこのアッセイを開始する。7日間摂氏37度でインキュベートし、凝集と毒性を誘発します。集約されたAベータ1-42のアリコートを準備し、使用するまでマイナス80度で保存します。
神経細胞培養の4日目に、前述のように1時間、0.5マイクロモル集合体Aβ1-42または車体溶液を1時間の0.5マイクロモル集合でウェルを治療する。時間が経過した後、培養培地を取り除き、すぐに4%パラホルムアルデヒドを含むニューロンをPBSで4%のパラホルムアルデヒドで直し、ホットプレート上で摂氏37度で1時間ずつ固定します。固定は、成長コーンの形状を維持することは、このプロトコルにとって重要であるため、最も重要です。
固定後、PBSでニューロンを3回洗浄します。次にチャンバーを取り外した後、水性取り付け媒体でニューロンを取り付ける。取り付け媒体を摂氏4度で2~4日間乾燥させます。
20X乾燥対物レンズを逆顕微鏡で取り込み、各井戸の全領域をキャプチャします。各ウェルの領域全体をキャプチャして分析することは、主観を避けるために重要です。ステージ3または4の各ニューロンの最も長い神経突起を軸索として分類する。
ラメリポディアを欠いているか、または3未満のフィロポディアを有する軸索成長コーンは、崩壊した成長コーンと考えられる。インキュベーション前にここに示されているベータ1〜42オリゴマーは、摂氏37度で7日間のインキュベーションの後に凝集する。凝集したAβ1-42で治療した後、ベータβの毒性オリゴマーに対する抗体による免疫染色は、β1-42治療ニューロン上で赤で陽性染色を示すが、車両治療ニューロンではない。
Aβ1-42治療によって誘発された初期の現象を、培養4日後に解析した。同定された軸索は、緑で示された樹状マーカーMAP-2に対する赤および陰性免疫染色で示される軸索マーカーτ-1に対する陽性免疫染色によって確認された。1時間の車両処理の後、成長コーンはラメリポディアといくつかのフィロポディアを広げました。
これらは健全な成長コーンとして同定された。逆に、A β1-42治療の1時間は、ラメリポディアまたはフィロポディアを発症しなかった収縮成長コーンにつながった。これらは崩壊した成長コーンとして同定された。
この手順を試みる間、この固定プロトコルを最高の状態で私もイッジするために摂氏37度で4%PFAと4%スクロースで細胞を固定することを忘れないでください。このプロトコルに従って、生細胞イメージングや遺伝子トランスフェクションなどの他の方法を実行して、軸索成長コーンが崩壊する時期と方法、および崩壊した成長コーンがどのように回収されるなどの追加の質問に答えることができます。
