これらの問題は、HIV感染の分子メカニズムと予後、遅延リザーバが確立される方法と場所など、HIV/AIDS研究の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、非侵襲的であり、HIV感染の影響を受けやすく、cARTを受容する移植されたヒト幹細胞に対する多系統開発を治療しなければならないhu-NSGマウスを確立した点である。消化されたヒト、胎児、肝臓組織、無菌、70マイクロメートル、ナイロン、メッシュストレーナーを介してスラリーサンプルを濾過し、単一細胞懸濁液を得、メーカーの指示に従って磁気活性化細胞のソートによってCD34 +HSCを濃縮します。
カウント後、氷上の新鮮なDPBS中のミリリットル濃度あたり20〜7番目の生存細胞でHSCを再中断する。次に、新生児のヒトNOD/SCID/γまたはNSGマウスのごみ全体を無菌のパイ型の照射ケージに入れ、セシウム137放射線源からのガンマ線の200〜250センチメートルで動物を治療します。その後、30ゲージの針を備えたカスタムメイドのハミルトン80508 50マイクロリットルシリンジに細胞をロードし、各新生児動物を5回の10〜5番目の実行可能なヒトCD34+HSCと25マイクロリットルのDPBSで肝臓に直接注入します。
感染後10~12週間、遠心分離により各マウスからのレトロ軌道、末梢、血液サンプルをスピンダウンし、プラズマをマイクロ遠心チューブに移して、実験的に適宜80°Cの陰性の貯蔵を行う。HSC生着検証のために、200マイクロリットルの赤血球溶菌バッファーでペレットを再懸濁し、1.5ミリメートルマイクロ遠心分離チューブで細胞懸濁液を室温で10分間のインキュベーションに引き出します。次に、新鮮な0.5ミリリットルの2回の洗浄、0.01%のウシ血清アルブミン、またはBSAの2回の洗浄のための遠心分離によって残りの白血球をDPBSで集める。
2回目の洗浄後、摂氏4度で20分間100マイクロリットルのブロッキングカクテルで細胞をブロックし、その後、1回1〜6番目の細胞濃度あたり2マイクロリットルの抗ボディで適切な抗ボディカクテルで標識します。摂氏4度で30分後、新鮮なDPBSとBSAで細胞を2回洗浄し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーで末梢血液サンプルを評価し、サンプルあたりヒトCD45+CD3+CD14+またはCD19+細胞の割合を定量化します。次に、CD4+対CD8+T細胞の比率を計算し、標準、定量、逆転写酵素、PCRプロトコルに従って、血漿サンプル中のウイルス負荷を評価します。
HIV感染の影響を評価するには、周囲の血液中のヒトCD45+細胞集団が20%を超える麻酔薬、ヒト、NSGマウスにHIVベールウイルスを送達し、腹腔内投与を介してマウス1回当たり20ナノグラムのP24で、2週間ごとにレトロ眼窩出血を介して血液サンプルを採取し、CD4-CD8比とウイルス負荷の両方を分析するを示すとおり。ウイルス抑制検証のために、感染したヒトのNSG動物に新鮮な、組み合わせ、抗レトロウイルス療法、またはcARTを、毎週4週間甘味水で供給し、2週間ごとにレトロ眼窩出血を介して血液サンプルを採取し、実証したようにCD4対CD8比と血漿ウイルス負荷の両方を分析する。血漿ウイルス負荷が検出限界を下回り、CD4-CD8比が1.5〜2.5の間に回復したときにウイルスリバウンドをアセスするには、cART離脱後2週間ごとにレトロ眼窩出血を通じて末梢血液サンプルを収集し、実証したようにサンプルを評価する。
最初の生着検査の間、ヒトCD45+細胞数は20〜80%の範囲で、ヒト白血球のサブセットはフローサイトメトリック分析によって離散集団として現れるべきである。CD4+対CD8+細胞の比率は健康な個体では1.5~2.5の間に残り、ウイルス感染時には顕著なCD4+T細胞の枯渇が典型的に観察される。特に、cART治療に応答して健全な比率が回復する。
感染の過程を通じて定量的なRT PCRによる血漿ウイルス負荷の検出とcARTレジメンをプロットし、それぞれウイルス送達および抗ウイルス治療の効率を評価するために使用することができる。この方法は、HIV/AIDSウイルス学研究や治療開発に関する洞察を提供することができますが、がん、糖尿病、自己免疫疾患などのヒト疾患に関連する他の研究にも適用できます。hu-NSGマウスモデルの開発は、免疫学および腫瘍学の研究者がヒトの新しい機能不全および病理、特にHIV慢性感染および待ち時間貯蔵所を標的とした機械学的および治療研究を探求する道を開いた。
