ラットを使用して、このプロトコルは、キメラHIVを使用してアクティブHIV感染の新しいモデルを確立するために使用することができます。ラットでは、薬物乱用と神経認知障害の研究のためのEcoHIV感染モデルの確立は、神経HIVおよびHIV-1関連神経認知障害の研究に有益であり得る。デモンストレーションの手順は、私の研究室の研究員であるハイロン・リーです。
ウイルスを293個のT細胞に包み込む場合、2つのゼラチンコーティングされた75平方センチメートルのフラスコのそれぞれに10%FBSを加えたDMEMのミリリットル当たり10〜5倍の293個のT細胞を種子化し、培養物が50%合流するまで37度で細胞を培養する。トランスフェクションの日に、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに750マイクロフラスコの培地で22.5マイクロリットルのトランスフェクション試薬を希釈し、溶液を3秒間渦巻く。キメラEcoHIVプラスミドDNAの20マイクログラムを250マイクロリットルの培地で20マイクログラム希釈し、フラスコ当たり1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを完全に混合します。
希釈したDNAと希釈トランスフェクション試薬を穏やかな混合と組み合わせ、得られた溶液を室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、各ウイルス懸濁液を10ミリリットルのプリウォームDMEM培地に加え、各ウイルス補充溶液を293個のT細胞の1フラスコに加える。2日間の細胞培養の後、遠心分離のためにフラスコから上澄み液を1本の50ミリリットルの円錐管に溜め、浄化された上清を新しい50ミリリットルチューブに移す。
透明化された上清に8ミリリットルのLenti-Xコンセントレータを加え、穏やかな反転と混ぜます。摂氏4度で2日間のインキュベーションを行った後、混合物を遠心分離し、慎重に上清を取り除き、100ミリモルPBSの100マイクロリットルでペレットを静かに再中断し、P24 ELISAキットを使用してウイルス濃度を引き立てる。EcoHIV-EGFP注射の場合、ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、脳領域から髪を剃り、70%エタノールとクロルヘキシジンベースのスクラブで露出した皮膚を2回殺菌する。
立体的な装置でラットを起こしやすい位置に固定し、頭皮の正中線に沿って皮膚を通して5〜6センチメートルの切開を行います。1つの掘削位置を0.8ミリメートル横に、1つの1.2ミリメートルのロストラルをブレグマにマークし、各頭蓋骨の位置で直径0.4ミリメートルの穴を開けます。10マイクロリットル注射器に1ミリリットル当たり6ミリのトランスダクションユニットに1.04倍をロードし、ステレオタキシック装置に注射器を固定します。
針を1つの穴の表面に近づけ、針を2.5ミリリットルの穴に差し込みます。1分間に0.2マイクロリットルのウイルスの速度で1マイクロリットルのウイルス溶液を注入する。すべてのウイルスが注入されたら、注射領域の中に針を5分間残してから、ゆっくりと針を引っ込めて、ラットの頭蓋骨の外に出るまで引き込みます。
4-0シルク糸縫合糸で皮膚切開を閉じ、溶液を70%エタノールで殺菌し、ラットを回復室に入れ、再発まで監視する加熱パッドを付けます。ウイルス注入後1~8週間、ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、ラットをヒュームフード内の上皮の位置に固定し、胸部中線に沿って皮膚を切開する。横隔膜を切って胸腔を開き、20ゲージを25ミリメートル針ずつ左心室に挿入します。
すぐにはさみで右心房を開き、毎分5ミリリットルの流量で50ミリリットルの予冷100ミリモルPBSを浸透させます。すべてのPBSが配信されたら、100ミリリットルの冷たい4%パラホルムアルデヒドをパーフューズします。すべての固定剤が送達されたら、頭蓋骨から脳を取り除き、新鮮な4%パラホルムアルデヒドで一晩組織を固定する。
翌朝、脳がチューブの底に落ち着くまで、脳がチューブの底に落ち着くまで、30ミリモルPBSの30%スクロースの40ミリリットルにサンプルを入れ、マイナス80°Cで2分間メチルブタノールで脳組織を凍結する。凍結後、マイナス20度のクライオスタットと細かいペイントブラシを使用して、厚さ50ミクロンのコロナセクションを取得します。すべてのセクションが得られたら、300マイクロリットルのアンチフェード媒体でサンプルを覆い、22の50ミリリットルのカバーリップで取り付けます。
培地が乾燥したら、共焦点顕微鏡で断面を画像化する。レンチウイルス注射の7日後、ラットコロナ脳スライス画像は、脳組織全体、特に皮質および海馬デンテート回内のEcoHIV-EGFPシグナルの有意な存在を明らかにする。Iba1およびEcoHIV-EGFPプローブとの二重標識は、ミクログリアが脳内のEcoHIV発現を有する主要な細胞型であるという強力な証拠を提供する。
感染後8週間、EcoHIV注射動物は生理学コントロールと比較して比較的平坦な間隔関数によって証明されるように、刺激間隔の操作に対して相対的な鈍感を示す。さらに、EcoHIV注射ラットは、制御動物に対する頭頸部径が増加した短い樹状脊椎の相対的頻度の増加によって証明されるように、樹状脊椎形態に深い変化を示す。立体性注入前の条件培地の濃度と濃度は、実験全体で一貫した複製可能な結果を確保するために重要です。
EcoHIVのこの特定の地域の立体態注入は、脳内の効率的なHIV感染を提供し、ラットの時間的処理の欠陥を生成する。ラットにおける立体性HIV注射を利用してEcoHIV感染モデルを拡張することは、目の前の神経HIVに関連する新しい質問に取り組む重要な機会を与える。
