Essas questões podem ajudar a responder a questões-chave na pesquisa sobre HIV/AIDS, como o mecanismo molecular e o prognóstico da infecção pelo HIV, e como e onde o reservatório de latência é estabelecido. A vantagem dessa técnica é que ela não é invasiva, e estabeleceu um camundongo hu-NSG que deve tratar um desenvolvimento de várias linhagens sobre células-tronco humanas transplantadas que são suscetíveis à infecção pelo HIV e são receptivos ao cART. Comece filtrando uma amostra digerida, humana, fetal, hepática, pasta através de uma amostra estéril, de 70 micrômetros, nylon, coador de malha para obter uma única suspensão celular, e enriqueça para CD34+HSCs por classificação celular ativada magnética de acordo com as instruções do fabricante.
Após a contagem, suspenda o HSC em duas vezes dez a sete células viáveis por concentração mililitro em DPBS frescos no gelo. Em seguida, coloque um ninhado de rato humano neonatal inteiro NOD/SCID/gama ou NSG em uma gaiola de irradiação estéril, em forma de torta, e trate os animais com 200 a 250 centígrados de raios gama de uma fonte de radiação césio-137. Em seguida, carregue as células em uma seringa padrão, Hamilton 80508 50-microliter equipada com uma agulha de calibre 30, e injete cada animal neonatal diretamente no fígado com CD34+HSCs humanos viáveis cinco vezes ao quinto e 25 microliters de DPBS.
Dez a doze semanas após a infecção, gire amostras de sangue retro-orbitais, periféricas e de sangue de cada rato por centrifugação, e transfira os superatas plasmádicos para tubos de microcentrifuuge para armazenamento negativo de 80 graus Celsius como experimentalmente apropriado. Para validação do enxerto de HSC, suspenda as pelotas com 200 microliters de tampão de lise de glóbulos vermelhos e puxe as suspensões celulares em um tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros para uma incubação de dez minutos à temperatura ambiente. Em seguida, colete os glóbulos brancos restantes por centrifugação para duas lavagens em 0,5 mililitros de albumina de soro bovino fresco, 0,01%, ou BSA, em DPBS por lavagem.
Após a segunda lavagem, bloqueie as células com 100 microliters de coquetel de bloqueio por vinte minutos a 4 graus Celsius seguido de rotulagem com o coquetel anti-corpo apropriado de interesse em 2 microliters de anti-corpo por uma vez uma-a-sexta células de concentração. Após 30 minutos a 4 graus Celsius, lave as células duas vezes em DPBS fresco mais BSA, e avalie as amostras de sangue periféricos por citometria de fluxo de acordo com protocolos padrão para quantificar a porcentagem de células humanas CD45+CD3+CD14+ou CD19+por amostra. Em seguida, calcule a razão das células CD4+to-CD8+T, e avalie a carga viral com nas amostras de plasma de acordo com os protocolos padrão, quantitativo, reverso, PCR.
Para avaliar os efeitos da infecção pelo HIV, entregue o vírus do fardo do HIV a camundongos anestesizados, humanos, NSG com uma população maior de 20% de cd45+células humanas em seu sangue periférico, a uma proporção de 200 nanogramas de P24 por concentração de camundongos através da administração intraperitoneal, coletando amostras de sangue através de sangramento retro-orbital a cada duas semanas, e analise tanto a razão CD4-CD8 quanto a carga viral plassmática , como demonstrado. Para a validação de supressão viral fornecer os animais NSG infectados e humanos com terapia fresca, combinatória, antirretroviral, ou cART, em água adoçada toda semana durante 4 semanas, coletando amostras de sangue através de sangramento retro-orbital a cada duas semanas e analisar tanto a razão CD4-CD8 quanto a carga viral plasmática como demonstrado. Para avaliar o rebote viral quando as cargas virais de plasma estão abaixo do limite de detecção e a razão CD4-CD8 é restaurada entre 1,5 e 2,5 coletar amostras de sangue periférico através de sangramento retro-orbital a cada 2 semanas após a retirada do CART e avaliar as amostras como demonstrado.
Durante a validação inicial do enxerto, a contagem humana de células CD45+deve variar de 20 a 80%, e os subconjuntos de leucócitos humanos devem aparecer como populações discretas por análise citométrica de fluxo. A razão entre células CD4+to-CD8+permanece entre 1,5 e 2,5 em indivíduos saudáveis, enquanto o esgotamento significativo das células CD4+T é tipicamente observado sobre a infecção viral. Notavelmente, a razão saudável é restaurada em resposta ao tratamento cART.
A detecção de cargas virais plasmáticas por RT PCR quantitativo ao longo da infecção e do regime cARTn pode ser plotada e utilizada para avaliar a eficiência do parto viral e do tratamento antiviral, respectivamente. Embora este método possa fornecer insights sobre estudos de virologia do HIV/AIDS e desenvolvimento terapêutico, ele também pode ser aplicado a outros estudos relacionados a doenças humanas, como câncer, diabetes e doenças autoimunes. O desenvolvimento do modelo de camundongos hu-NSG abriu caminho para pesquisadores em imunologia e oncologia explorarem uma nova disfunção e patologia em humanos, particularmente estudos mecanicistas e terapêuticos voltados para a infecção crônica do HIV e o reservatório de latência.
