このプロトコルの全体的な目的は、ヒト造血幹細胞およびヘパト部位を用いて、機能的ヒト免疫系と肝臓を有するヒト化マウスモデルを生成することである。この方法は、遺伝子肝ヒト化マウスの主要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、HIVによって引き起こされる免疫病理学を研究するための強力なツールを提供します。
このプロセスのデモンストレーションは、病理学と微生物学部門のスーパーバイザーであるYimin Sunと、研究技術者のウェイミン・ワンとエドワード・マカロフが行います。まず、ヘパリンチューブで採取した臍帯血を滅菌層流れキャビネットに移します。35ミリリットルにボリュームが増加するまでPBSを追加します。
サンプルをリンパ球分離培地の上に重ね、遠心分離機でGを400倍、摂氏4度で35分間、休憩を取らずに重ねます。次に、上部のプラズマ層を慎重に取り外し、トランスファーピペットを使用して白いバフィーコートインターフェースを新しいチューブに移します。30~40ミリリットルの氷冷バッファーでバフィーコートを再中断します。
ピペットを使用して、セル懸濁液の20マイクロリットルを0.4%トリパンブルーの20マイクロリットルと組み合わせます。この混合物のピペット10マイクロリットルは、計数スライドの2つのチャンバーのどちらかの外側の開口部に、セルをカウントするために自動化されたセルカウンターにスライドを挿入します。細胞をGの300倍、摂氏4度で10分間遠心分離する。
上清を慎重に吸引し、300マイクロリットルの氷冷バッファーを加えます。100マイクロリットルのヒトFC受容体遮断試薬と100マイクロリットルのモノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体を最大1億個の細胞に結合させたマイクロビーズを加える。摂氏4度で30分間インキュベートします。
10ミリリットルの氷冷バッファーを加え、細胞を洗浄し、遠心分離機でGの300倍、摂氏4度を10分間加えます。上清を慎重に取り除き、500マイクロリットルの氷冷バッファーでペレットを再懸濁します。この後、磁気活性化細胞選別フィールドに正の選択LS列を配置し、氷冷バッファーの3ミリリットルでそれを通過します。
サンプル内のヒトCD34陽性細胞に結合したマイクロビーズを捕捉できるLSカラムにサンプルをロードし、重力の影響下でコレクションチューブに流れ込むことができます。氷冷バッファーでカラムを3回洗浄し、同じコレクションチューブに溶出液を集めます。次に、5 ミリリットルの氷冷バッファーでカラムを突き飛ばして、CD34 陽性細胞を新しいコレクションチューブに入れます。
90%以上の純度を達成する手順を繰り返し次に、トリパンブルー色素とヘモサイトメーターを使用して、排除されたCD34陽性細胞を数える。計数後、5分間Gの300倍で細胞を遠心分離する。上清を捨て、細胞をPBSの125マイクロリットルで再中断し、注射をすぐに移植に使用します。
CD34陽性溶離液の純度を確認するには、懸濁液の50マイクロリットルを取り、30分間摂氏4度で10マイクロリットルのPE共役抗ヒトCD34抗体と共にインキュベートします。この後、PBS内の細胞を洗浄し、再懸濁し、フローサイトメトリーを行う。取得後、テキストプロトコルに示されているデータを分析します。
まず、テキストプロトコルで概説されているように、凍結保存された肝細胞を取得して解凍します。次に、バイオキャップを取り除き、解凍した肝細胞を温めた解凍媒体を含む50ミリリットルの円錐状チューブに注ぎます。チューブを手で数秒揺らし、細胞を一時停止します。
細胞をGの100倍、室温で8分間ペレットする。ペレット化した細胞をPBSで0.1%BSAで洗浄し、PBSの新鮮なHSPCsまたは解凍したHSPCsを使用して、1個のマウスあたり80マイクロリットルの最終体積にプールします。まず、滅菌延長チューブの一方の端を30ゲージ針に取り付け、もう一方の端を1ミリリットルのシリンジに取り付けます。
シリンジにプールされたHEPとHSPの懸濁液を充填し、反復塗布ピペットのノッチに注射器をフィットさせ、ディスペンサーを調整して各プレスで10マイクロリットルを分配します。テキストプロトコルで概説されているように各マウスを剃り、10%ポビドーネで各マウスの体の左側をスクラブし、70%イソプロピルアルコールに続きます。
Vannas型はさみを使用して、胸壁の左側の皮膚、筋肉および腹膜に小さな切開を行い、肋骨ケージの下端から約5ミリメートル下の腹腔に入ります。脾臓を見つけ、簡単にアクセスするために操作領域にわずかに引っ張るために鉗子を使用し、脾臓の下極に30ゲージの針を挿入します。次に、分配ピペットのプランジャーのロックを解除し、脾臓あたり60〜80マイクロリットルの制限で、一度に体積の10マイクロリットルを分配します。
針をゆっくりと引っ込め、ライゲーションアプライヤーを使用してリゲーティングクリップで脾臓をクリップします。次に、無菌PBSで濡れた綿先端アプリケーターを使用して脾臓を体腔に押し戻します。中断された縫合パターンを使用して、腹壁の筋肉層を閉じます。
非吸収性縫合糸を使用して中断された縫合線パターンで皮膚閉鎖を達成する。すべての必要な材料を指定されたバイオセーフティレベル2プラス施設に移します。ウイルスと一緒に作業中に、すべてのガウン、靴カバー、フェイスマスク、カット耐性手袋を含むダブル手袋を含む個人用保護具を常に着用してください。
ヒトCD45陽性細胞の15%以上の再構成を有し、HIV-1感染のための血清中にヒトアルブミンの存在を有するマウスを選択する。腹腔内にマウスに1,000~10,000の組織培養感染量50HIV-1 ADAを1匹あたり100~200マイクロリットルの体積で注入する。マウスを安楽死させた後、テキストプロトコルに概説されているように、各マウスから肝臓を切除する。
一晩4%パラホルムアルデヒドで肝臓を収集し、修正します。ヒト肝臓と免疫細胞を持つ二重ヒト化マウスモデルの確立は、それぞれ非常に簡単なELIZAとフローサイトメトリーを用いて各ステップで容易に監視することができる。フローサイトメトリーは、機能性免疫系の発達を評価し、HIV感染が免疫細胞に及ぼす影響を確認するために定期的に行われる。
二重ヒト化マウスでは、機能的免疫細胞の発達はリンパ球ゲートの15〜90%の範囲であり得る。ヒト肝細胞の生着の評価のために、ヒト特異的なアルブミンレベルに対するELIZAは、マウス血清上で毎月行われる。HSPとHEPの両方を用いたマウスは、1ミリリットル当たり約7マイクログラムから1ヶ月あたり377マイクログラムまでのヒト特異的アルブミンレベルを示し、観察の時間をかけて成長し続ける。
二重ヒト化マウスの血液中のヒト免疫細胞に対するHIV感染の影響は、ヒト特異的アルブミンELIZAによって肝臓のフローサイトメトリーおよびHEPによって監視される。5週間までに、HIV-1は血清中のヒトアルブミンレベルの低下を引き起こし、二重ヒト化マウスの肝臓切片にヒトCK18陽性肝細胞が枯渇する。CD4対CD8の比率は、感染前の同じマウスに記載されたレベルと比較して、HIV感染マウスの血液および肝臓で典型的に観察される。
血液は、バフィーコートの分離のためにリンパ球分離媒体の上に慎重に重ねるべきです。手術のために、脾臓を優しく保持し、脾臓の下極に針を挿入します。造血幹細胞の単離に続いて、CD34陽性造血幹細胞の純度をチェックして、CD3陽性細胞および異なるドナーからの肝細胞の急性注射を避けることは重要です。
ヒト化マウスはヒト免疫系と肝臓の生理学的側面を示すため、開発されたマウスはHIVおよび身体的感染症および肝硬変の生理病原性を研究するために利用することができる。
