クリスティーナ ピルガキ、タオ トンとアリソン北支援のロックフェラー大学のバイオ リソース センターから感謝し、サポートします。我々 はまた、動画編集のため Xiphias Ge 朱を感謝します。この作品は、人間フロンティア科学プログラム組織 (PC) によってサポートされていました。

動物の世話や実験は動物介護の施設およびロックフェラー大学の使用委員会によって承認された手続きに従って行われました。
1. ティッシュの準備
<ol><li>血液が組織から完全に削除されるまでは、4 ° C でリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 〜 20 ml 標準心内血流を実行します。</li>
	<li>首と尾が大幅補強まで固定液 (1 × PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)) 4 ° c の ~ 20 mL に、出納を切り替えます。 注意: PFA は有毒です。皮膚、目、粘膜との接触を避けます。ヒューム フード内ソリューションで行われる必要があります。</li>
	<li>慎重にそれを損なうことがなく全体の脂肪パッドを削除する興味の脂肪パッドを解剖します。摘心や組織の圧迫を避けるために鈍終了鉗子を使用します。任意の毛皮と切り裂かれたティッシュが汚れない。</li>
	<li>後 4% PFA 1x PBS では 4 ° C で一晩で組織を修正します。それぞれの脂肪パッド 〜 10 ml の 15 mL の円錐管に固定の解決の修正後。</li>
	<li>常温 (RT) 組織 1 × PBS に 3 回 (1 h) を洗います。</li>
	<li>4 ° C で 1 × PBS で短期 (2 週間まで) の組織を保存し、光から保護されています。長期的なストレージ (例えば1-2 年)、(防腐剤) として 0.05% アジ化ナトリウムと 1x PBS にバッファーを切り替えます。 注意: アジ化ナトリウムは経口摂取したり、皮膚から吸収されると非常に有毒です。アジ化ナトリウム (5% 以上) のソリューションは、ヒューム フードの下処理必要がありますに集中しました。</li>
</ol>2. 脱脂・透過
タイミング: 1-2 日
<ol><li>20%、40%、60%、80% メタノール グラデーション B1n バッファー (表 1) (v/v)、例えば20% メタノール/B1n のバッファーを用意し、メタノール 20 mL、80 mL の B1n バッファーをミックスします。4 ° C ですべてのバッファーを保存します。グリシン結晶を飽和のための 60% と 80% のメタノール/B1n バッファーから沈殿させます。結晶; を削除しないように次の洗浄溶液を使用します。 注意: メタノールは揮発性、刺激性、可燃性です。皮膚や眼との接触を避けます。</li>
	<li>優しく解剖顕微鏡の下でサンプルから髪を削除します。毛や糸くず、破片のサンプルに添付画像の中に影を引き起こすが。新しい管に洗浄のサンプルを転送します。</li>
	<li>特に明記しない限り、次のすべての手順を氷の上または 4 ° C で実行します。(例えば、若い無駄のないマウスから後部の perigonadal/皮下脂肪パッド) の小さいサンプル ソリューションの 1.6 ml 2 mL 遠心管を使用します。大規模なサンプルや高脂質のコンテンツ (例えば、肥満マウスの脂肪パッド) とサンプル溶液 4 mL と 5 mL の管を使用します。<ol>
<li>設定軌道シェーカーに水平にサンプルを含むチューブを配置 ~ 100 rpm。チューブ内のサンプルが自由に移動できることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>指定された時間 (表 2) の 20%、40%、60%、80%、100% のメタノール/B1n バッファーの傾斜シリーズのサンプルを脱水します。キャリー オーバー ソリューションを最小限に抑えます。</li>
	<li>Delipidate 100% ジクロロ メタン (DCM) でサンプル (3 回)、インキュベーション時間をそれぞれ表 2に示されています。サンプルは、2 番目と 3 番目の DCM 洗浄の端に管の底に沈む必要があります。そうでない場合は完全脱脂を確実にインキュベーション時間を延長 (例えば1-2 h を 30 分延長)。 注意: DCM は、ヒューム フード内部処理必要があります。ガラス容器を使用して、ストレージと遠心チューブの孵化用ポリプロピレンから作られています。マイクロ遠心チューブ用は、DCM の長期保管に使用しないでください。ペトリ皿とポリスチレンから作られた血清ピペットは DCM と互換性がありません。DCM は、揮発性の高い。乾燥を防ぐために迅速に新鮮なソリューションには、サンプルを転送します。</li>
	<li>指定された時間 (表 2) の 100% メタノールで二回洗います。</li>
	<li>オプション: サンプルをよく灌流できない場合は、残りの赤血球からヘモグロビンの色可能性があります蛍光が強い。4 ° C で一晩メタノール (メタノールの 5 冊を 30% H2O2の 1 巻) で 5% H2O2でブリーチします。</li>
	<li>逆メタノール/B1n バッファー シリーズのサンプルを水分補給: 80%、60%、40%、20% メタノール/B1n、100 %b1n バッファー (2 回) に示されている (表 2)。</li>
	<li>室温 2 時間 PTxwH バッファー (表 1) とサンプルを洗う</li>
	<li>4 ° c (最大 1 年間) PTxwH バッファーに脱脂サンプルを格納またはすぐに染色手順に進みます。</li>
</ol>3. 全体のマウント免疫染色
タイミング: 8-10 日
注: 次の手順のすべて行なう RT で揺れ光からの保護と明記しない限り。小さいサンプル 1.6 mL の溶液を 2 mL 遠心管を使用します。大規模なサンプル溶液 4 mL と 5 mL の管を使用します。組織またはメタノール処理ティッシュ セクションの小さな断片の抗体は、まず検証することをお勧めします。
<ol><li>PTxwH バッファー推奨濃度に一次抗体を希釈します。導入の抗体の沈着物や集計を防ぐために 10 分間 ~ 20,000 × g で希釈した抗体溶液を遠心します。</li>
	<li>第一抗体溶解液で脱脂サンプルを指定の時刻 (表 2) にインキュベートします。</li>
	<li>一連のインキュベーション手順 PTxwH バッファーのサンプルを洗う: 5 分、10 分、15 分、20 分、1 h、2 h、4 h、一晩。</li>
	<li>推奨濃度 PTxwH バッファー内の二次抗体を希釈します。導入の抗体の沈着物や集計を防ぐために 10 分間 ~ 20,000 × gで希釈した抗体溶液を遠心します。 注: 組織の自家蛍光による高いバック グラウンドを避けるためには、赤、赤外領域の光を発する fluorophores が付いている二次抗体が推奨されます。レーザー顕微鏡の利用可能な回線数に応じて 3-4 マーカーまでを 1 つのサンプルで同時にイメージすることができます。</li>
	<li>二次抗体溶液とサンプルを指定の時刻 (表 2) にインキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション手順のシリーズに PTxwH を洗ってサンプル: 5 分、10 分、15 分、20 分、1 h、2 h、4 h、一晩。</li>
	<li>オプション: 壊れやすい、組織タイプの 4% PFA 1x PBS で一晩組織形態を保持するために 4 ° c でのステンド グラスの組織を固定します。 注: この手順では、画像の背景が増加します。脂肪組織に対してこの手順を実行する必要はありません。</li>
	<li>一連のインキュベーション手順 1 × PBS でサンプルを洗う: 5 分、10 分、30 分。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下でサンプルから糸くずを注意深く取り外します。</li>
</ol>4. 組織クリア
タイミング: 1-2 日
<ol><li>オプション: 光シート顕微鏡のサンプル実装を容易にするために agarose のサンプルを埋め込みます。 注意: この手順がイメージング中にその形状を安定させるために脂肪組織を強く推奨します。<ol>
<li>1x PBS (w/v) の 1% の agarose が付いて埋め込みソリューションを準備します。埋め込みソリューションのクールな 〜 過度の熱にサンプルを公開することを避けるために 40 ° C。</li>
		<li>(例えばペトリ皿、ボートの重量を量る) 金型に洗浄のサンプルを置き、目的の位置に配置します。任意の液体の持ち越しを避けてください。埋め込みソリューションをサンプルにそっと注ぐ。空気の泡を避けるため。</li>
		<li>サンプルを含むブロックを右カットで完全に固めるアガロースをしましょう。 注: すべて夜通し孵化を含む次の手順する必要があります実施常温では、揺れと光からの保護。小さいサンプル 1.6 mL の溶液を 2 mL 遠心管を使用します。大規模なサンプル溶液 4 mL と 5 mL の管を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>指定された時間 (表 2) H2o: 25%、50%、75%、100% (3 回) とメタノール グラデーションのサンプルを脱水します。 注: サンプルは、100% メタノールのステップで一晩左することができます。</li>
	<li>振動 (3 回) で 1 時間 100 %dcm でサンプルをインキュベートします。サンプルは、各 DCM の洗浄の最後に管の底に沈む必要があります。されていない場合は、メタノールの完全除去を確保するインキュベーション時間を延長します。サンプルは 100 %dcm ステップで一晩します。</li>
	<li>屈折率整合を達成するために穏やかな揺れで一晩ジベンジル エーテル (DBE) にサンプルをインキュベートします。 注: サンプルは透明可視光になります。 注意: DBE は危険です。皮膚との接触を避けてください。二重の手袋で発煙のフードの中それを処理します。それが DBE で汚染されているとすぐに手袋を破棄します。・遠心チューブ (ポリプロピレン) の孵化のためのガラス容器を使用します。マイクロ遠心チューブ用は DBE の長期保管に使用しないでください。ペトリ皿とポリスチレンから作られた血清ピペットは DBE と互換性がありません。100% エタノールと任意の流出をクリーンアップします。</li>
	<li>軽度の揺れ 2 h. ストアの暗闇の中で常温サンプル新鮮な DBE でサンプルをインキュベートか画像に直接進みます。 注: サンプルは、一ヶ月内でイメージを作成する推奨されます。特定 fluorophores が付いている他のものより安定して、この段階でサンプルの長期保存はお勧めできません。</li>
</ol>5. 顕微鏡
<ol><li>DBE と互換性のある光シート顕微鏡とイメージング。 注: 有機溶剤ベースのイメージングのために承認され、DBE の屈折と一致する唯一の目的は、イメージングの DBE 浸漬の目的を浸漬として使用できます。<ol>
<li>イメージ投射の間の動きを防ぐことができますホルダーに agarose 埋め込まれたサンプルをマウントします。DBE で満たされた室に試料を浸します。</li>
		<li>Z スタックの (例えば1-2 X 倍率) 全体組織分布/構造の興味のマーカーを取得するサンプル全体をカバーを収集します。</li>
		<li>(例えば4-12 倍の倍率) 詳細な構造を画像に関心の領域を拡大する高倍率で客観的に切り替えます。 注: コラーゲンはすべて脂肪細胞13を囲む脂肪組織の細胞外マトリックスへの主要コントリビューターであります。コラーゲンは約 400 に至るまで典型的な発光スペクトル 550 nm14nm。イメージング (緑) 488 レーザー ラインでサンプルとコラーゲン (例えば、525 550 nm) の発光スペクトルの中にある波長範囲で発光を収集は以前に示された組織の自家蛍光信号を提供します。脂肪細胞の輪郭と全体的な組織アーキテクチャ12を描きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>逆に共焦点イメージングまたは 2 光子顕微鏡。<ol>
<li>すべてのプラスチック部品 (またはシールすることができます他の DBE 互換イメージング室) に触れることがなくガラス底のチェンバー スライドに agarose 埋め込まれたサンプルを配置します。DBE が漏れないことを確認します。</li>
		<li>長距離より深い浸透を達成するために作業の目的を選択します。 注: 画像はチェンバー スライドのガラス底を通って倒立共焦点または 2 光子顕微鏡とされるべきであります。サンプルと DBE ベースのイメージングのための提案は、目標を浸漬との直接接触を避けます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+We+Talk+About+When+We+Talk+About+Fat.">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. 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J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+Simple,+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging.">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density.">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li><li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis:+Role+of+Collagen+VI.">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li><li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging:+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis.">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li><li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice.">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li><li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans.">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li><li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

裏打ちクリアは正規のラボ環境のセットアップで簡単に行うことができる脂肪をクリアするための簡単かつ堅牢なメソッド。IDISCO など他の溶剤ベースの清算方法と比較して/iDISCO +10、11,12、裏打ちクリア、特に脂肪組織と他の組織と高脂肪の内容をクリアに最適化されています。脱脂ステップ脂肪から脂質を完全に削除し?...

最近まで、脂肪組織は、脂肪細胞の非晶質のコレクションとしての考案されました。過去数十年間は、我々 の理解は脂肪の脂肪細胞と脂肪細胞の前駆物質の種類、免疫細胞、線維芽細胞、血管、および神経投射を含む複雑な器官であると認め今より洗練されたきました。これらの居住者の脂肪細胞間の相互作用は、脂肪組織と個体の生理学と病態生理学1に及ぼす影響を発音しています。新興の研究は、特定の相互作用の基礎となる重要な分子メカニズムを解明している、信頼性の高い構造プロファイリング 3 次元 (3 D) で全体の組織のより包括的な理解が必要です。
脂肪組織の形態の私達の現在の知識は薄いセクション (5 μ m) を比較的高倍率 (10 倍以上) の組織学的分析に基づいて2,3。ただし、この方法には、いくつかの重要な制限があります。交感神経や血管、脂肪関数4,5,6,7で重要な役割を再生する知られているなどまず、複雑な糸状構造が評価することは困難薄いセクションで。第二に、その一見アモルファス形状とに集中する代表的な構造の単位の不足、セクション染色のみに基づいて脂肪組織構造を理解することは困難です。第三に、脂肪組織が 3 D 解剖学的再建、従来の全脳形態8を研究するために使用に適した一貫性のある連続切片を得ることに課題を作成する、非常に高い脂質含量です。これらの要因を考えると、携帯電話の解像度を実現しながら全体の脂肪デポの 3次元可視化を提供することができますマウント全体アプローチのための大きい必要性があります。
臓器全体の体積の 3 D イメージングによる光の拡散効果のあいまいに挑戦しています。生体内光散乱の主な原因は、脂質水溶液の界面から来ています。脂質を除去することによって散乱を除去するために努力は、世紀以上にわたっての継続されていますが、最近の技術革新の9の数が多いがありました。そのような新しく開発された組織のクリア メソッドは溶媒消去臓器の反応が有効な 3 D イメージング (iDISCO/iDISCO +)10,11。ただし、脂肪組織が脂質の高レベルを与えられた特定の課題を提示し、したがって、iDISCO に修正を加える/iDISCO + プロトコルは完全に崩壊から組織を保護しながら脂質を抽出するために必要な。裏打ち-クリアと呼ばれる、開発した修正されたプロトコルでは、高分解能体積画像12に適した最適な透明度を達成するために脂肪の脱脂をメタノール/ジクロロ メタン ベースを採用しています。脱脂は、GFP や RFP など主として内生表現渇き蛍光タンパク質ステップので、そのようなタンパク質の可視化は、反応によって達成されなければなりません。全体的にみて、このシンプルで堅牢なプロトコルは居住者の脂肪細胞の組織レベルの組織を研究に適用できる脂肪細胞の前駆細胞と脂肪の形態の開発中にトレースする血統。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3393-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl ether</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71289-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB152</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3628</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1957</td>
			<td>Final concentration of 2 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>712-605-153</td>
			<td>Final concentration of 5-10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>80287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet microscope</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Ultramicroscope II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>LaVision BioTec</td>
			<td>Imspector software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy visualization software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue

脂肪組織は、エネルギー代謝と体温調節に中心的な役割を果たしています。それは脂肪細胞と同様、脂肪細胞の前駆物質、免疫細胞、線維芽細胞、血管、神経投射の種類で構成されます。その分布と建築の可視化によるこれらの居住者の脂肪細胞のより包括的な理解を実現できますが、特定の細胞の分子制御とこれらの細胞の相互関係をますます線引きされている,全体全体の組織。脂肪組織を分析する既存の免疫組織染色と蛍光抗体法のアプローチは、薄いパラフィン埋め込まれたセクションに依存します。ただし、薄片組織の小さな部分のみをキャプチャします。その結果、結論は組織のどの部分を分析によってバイアスすることができます。したがって全体の脂肪組織における分子・細胞パターンの包括的三次元視覚化を許可する技術、裏打ちクリアをクリア脂肪組織を開発しました。裏打ちクリア iDISCO から適応された/iDISCO + は、特定の変更に対するネイティブの組織形態を維持しながら、組織に格納されている脂質を完全に削除します。光シート蛍光顕微鏡と組み合わせて、ここで全体の脂肪組織の高分解能の 3次元濃淡画像の取得に裏打ちクリア メソッドを使用を示します。

裏打ちクリア準備全体の脂肪パッドの細く、肥満の州の組織形態や細胞間相互作用の影響を分析する 3 D でイメージを作成することができます。このメソッドは、緑のチャネルで組織の自家蛍光信号を集めることによって脂肪の一般的な構造を分析する簡単に適用できます。我々 は以前に、自発蛍光染色、成熟脂肪細胞12をアウトラインに一般的に?...

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Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

高脂質含量のため従来の組織学的方法を使用して視覚化する脂肪組織にチャレンジしております。裏打ちクリアは、堅牢なラベリングと脂肪組織の高分解能体積蛍光イメージングができるテクニックをクリア組織です。ここでは、試料調製、前処理、染色、クリア、およびイメージング用取付方法をについて説明します。

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

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JoVE Journal

Biology

26.9K ビュー.  The Rockefeller University. 高脂質含量のため従来の組織学的方法を使用して視覚化する脂肪組織にチャレンジしております。裏打ちクリアは、堅牢なラベリングと脂肪組織の高分解能体積蛍光イメージングができるテクニックをクリア組織です。ここでは、試料調製、前処理、染色、クリア、およびイメージング用取付方法をについて説明します。

ビデオ: Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

生物学

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

イモリのレンズ再生を研究するために培養虹彩色素上皮細胞のためのシステム

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

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Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-PRESTO：生体組織のクリアとボリュームイメージングのための免疫標識方法

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various techniques have been developed to study the morphology and biology of adipose tissue. However, conventional visualization methods are limited to studying the tissue in 2D sections, failing to capture the 3D architecture of the whole organ. Here we present whole-mount staining, an immunohistochemistry method that preserves intact adipose tissue morphology with minimal processing steps. Hence, the structures of adipocytes and other cellular components are maintained without distortion, achieving the most representative 3D visualization of the tissue. In addition, whole-mount staining can be combined with lineage tracing methods to determine cell fate decisions. However, this technique has some limitations to providing accurate information regarding deeper parts of adipose tissue. To overcome this limitation, whole-mount staining can be further combined with tissue clearing techniques to remove the opaqueness of tissue and allow for complete visualization of entire adipose tissue anatomy using light-sheet fluorescent microscopy. Therefore, a higher resolution and more accurate representation of adipose tissue structures can be captured with the combination of these techniques.

The focus of the present study is to demonstrate the whole-mount immunostaining and visualization technique as an ideal method for 3D imaging of adipose tissue architecture and cellular component.

全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. Accordingly, techniques for harvesting and processing human adipose tissue have evolved in order to quickly and efficiently obtain large amounts of tissue. Among these, the closed system technology represents an innovative and easy-to-use system to harvest, process, and re-inject refined fat tissue in a short time and in the same intervention (intra-operatively). Adipose tissue is collected by liposuction, washed, emulsified, rinsed and minced mechanically into cell clusters of 0.3 to 0.8 mm. Autologous transplantation of mechanically fragmented adipose tissue has shown remarkable efficacy in different therapeutic indications such as aesthetic medicine and surgery, orthopedic and general surgery. Characterization of micro-fragmented adipose tissue revealed the presence of intact small vessels within the adipocyte clusters; hence, the perivascular niche is left unperturbed. These clusters are enriched in perivascular cells (i.e., mesenchymal stem cell (MSC) ancestors) and in vitro analysis showed an increased release of growth factors and cytokines involved in tissue repair and regeneration, compared to enzymatically derived MSCs. This suggests that the superior therapeutic potential of microfragmented adipose tissue is explained by a higher frequency of presumptive MSCs and enhanced secretory activity. Whether these added pericytes directly contribute to higher growth factor and cytokine production is not known. This clinically approved procedure allows the transplantation of presumptive MSCs without the need for expansion and/or enzymatic treatment, thus bypassing the requirements of GMP guidelines, and reducing the costs for cell-based therapies.

Here, we present human adipose tissue enzyme-free micro-fragmentation using a closed system device. This new method allows the obtainment of sub-millimeter clusters of adipose tissue suitable for in vivo transplantation, in vitro culture, and further cell isolation and characterization.

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

In the past decade, adipose tissue transplants have been widely used in plastic surgery and orthopaedics to enhance tissue repletion and/or regeneration. ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.