免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

大規模な多細胞構造の研究に対する関心の高まりは、透明臓器内の大きな構造の3次元可視化と定量化を可能にするこの光学クリアリング技術の開発につながった。このプロトコルは、簡単で安価で簡単に設定でき、3次元で組織を調査するための包括的なツールを提供します。疾患の多層的性質は、常に伝統的な2次元技術によってシミュレートされるとは限りません。

組織の三次元分析は、より良い診断と病気を監視するのに役立ちます。この方法は腎臓組織に限定されず、任意の正常な、病気の組織に適用することができます。この単純なプロトコルは、動物の取り扱いのいくつかの経験を持つ任意の科学者のために従うのは簡単です。

抗体標識が悪い場合に異なる抗体を試験し、二次抗体のみを制御することが重要です。まず、原稿の指示に従って1X PBSでPBSと3.0%パラホルムアルデヒドを含むヘパリンを調製し、溶液を別々の50 mLプラスチック注射器に移します。パラホルムアルデヒドは有毒であり、ヒュームフードに用意する必要があります。

原稿の指示に従って腎臓を収集し、多用する。その後、カプセルを取り出し、腎臓を1mmの厚さのコロナスライスに切ります。準備したパラホルムアルデヒド溶液を15 mL円錐形チューブに浸します。

固定後、腎臓スライスを1X洗浄バッファで1時間洗い、次に抗原検索を進めます。500 mL ビーカーで1X抗原マスク解除液の300 mLを加熱します。次に、腎臓スライスを加熱されたバッファーに透過性の埋め込みカセットに入れ、92~98°Cで1時間かき混ぜます。

この抗原検索工程では、温度を92~98°Cの間で安定に保つことが重要です。その後、スライスを0.1%Triton X-100で1X洗浄バッファの10 mLに移し、一晩揺らします。翌日、10mLの新鮮な1X洗浄バッファーでスライスを1時間洗います。

一次抗体を500マイクロリットルの正常な抗体希釈液で希釈します。37°Cで4日間希釈された一次抗体で腎臓スライスを穏やかに揺らす。インキュベーション後、腎臓スライスを1X洗浄バッファーの10mLで一晩室温で洗浄し、8時間後にバッファーを1回交換します。

二次抗体を500マイクロリットルの正常な抗体希釈希釈し、37°Cで4日間腎臓スライスでインキュベートする。このステップから、腎臓のスライスは光から保護されるべきであることに注意してください。二次抗体でインキュベーションした後、腎臓スライスを10 mLの1X洗浄緩衝液で一晩室温で洗浄する。

腎臓スライスを脱水するには、高品位100%エタノールの5mLに移し、室温で2時間揺らし、1時間後にエタノールをリフレッシュする。腎臓スライスをエチルシナメートの2mLに浸し、一晩穏やかに揺れます。組織を画像化する準備ができたら、600〜1000マイクロリットルのエチルシナメートをガラス底皿に加え、腎臓スライスを皿に移します。

腎臓スライスに丸いカバースリップを置き、パラフィンフィルムで皿を密封します。皿を顕微鏡の撮像プラットフォームに置き、原稿の指示に従ってティッシュをイメージする。このプロトコルは、腎臓組織の3D解析を成功させ、細胞の機能と相互作用を評価するために使用されています。

この方法は、蛍光レポーターの急行を引き起こす可能性がありますが、他の強力な蛍光タンパク質は、シグナルクエンチングに抵抗する可能性があります。腹部大動脈拡散は、抗体拡散を改善することができる。場合によっては、抗体の侵入が悪いと表面的なシグナルが生じます。

これは、より高濃度または抗体の補充で補正することができます。対象となる抗原が腎臓血管系で発現する場合は、血管内送達を考慮すべきである。しかしながら、尿細管上皮細胞の有端膜内のタンパク質を標的とする抗体は、糸球体濾過障壁を越えて非特異的なシグナルを引き起こさない。

この組織は、特定の細胞集団を検出するか、細管セグメント全体を可視化するために抗体で標識することができる。さらに、3Dにおけるタンパク質の共局在化は、複数の抗体を組み合わせることによって達成することができる。抗体標識は、良好な腎臓拡散、抗原検索ステップの使用、および高い抗体濃度で改善できることを覚えておくことが重要です。

いくつかの強力なレポータータンパク質は、このプロトコルに従って蛍光シグナルの消光に抵抗する可能性があります。これをテストするために、抗原検索および抗体標識のステップをスキップする。この技術は、構造の立体的性質を尊重し、研究のための多くの新しい分野を開きます。

従来の 2 次元解析に関連する必要な仮定と干渉を排除します。