これらのプロトコルはマウス脂肪組織のバレエ顕微鏡上の非常に大きい人間の三次元構造の分析を可能にする。脂肪組織の構造変化と病理学的機能不全の結合を促進する。この清算プロセスは非常に簡単で、組織を脂肪化し、他の明確なプロトコルと比較してエタノールやメチルサリチル酸などの毒性の低い溶媒を使用して、暖かいマウスで人間をクリアするのに非常によく適応しています。
採取したマウスまたはヒト白色脂肪組織を、PBSの4%パワーホルムアルデヒドの少なくとも10ミリリットルに、化学フードの下で優先的に15ミリリットルのプラスチックチューブに浸すことから始めます。一晩摂氏4度でローリングプレートにチューブを移す前に、室温でローリングプレートの組織を1時間振ります。翌朝、固定白脂肪組織をPBSの10ミリリットルで室温で5分間洗いすぎ、固定剤のすべての痕跡を取り除き、PBSで10ミリリットルの0.3%グリシンを含む15ミリリットルチューブに組織を移し、1分あたり100回転の軌道シェーカーで室温で1時間インキュベーションする。
残りの遊離アルデヒド基がクエンチされた場合、10ミリリットルの0.2%トリトンX-100を含む15ミリリットルのチューブに、37°Cで振る2時間のインキュベーションを行う。インキュベーションの終わりに、一晩摂氏37度で振る0.2%トリトンX-100と20%DMSOの10ミリリットルで組織を治療します。翌朝、10ミリリットルの0.1%Tween 20、0.1%トリトンX-100、0.1%デオキシコール酸、20%DMSOを含む15ミリリットルのプラスチックチューブに組織を浸し、37°Cで少なくとも24時間インキュベートします。
インキュベーションの終わりに、PBSで10ミリリットルの0.2%トリトンX-100で、1分間に100回転/分でオービタルシェーカーで組織を1時間リンスします。その後、15ミリリットルの0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAをPBSで37°Cで12時間浸漬し、揺れで37度に浸漬した。白色脂肪組織の染色のため。
組織を0.2%トリトンX-100、10%DMSO、PBSの3%BSAの300マイクロリットルに移し、1.5ミリリットルマイクロチューブの目的とする一次抗体を補い、アルミニウム箔で光から保護し、チューブを50ミリリットルのファルコンチューブに入れる。チューブを軌道シェーカーに入れ、2日間のインキュベーションを摂氏37度で揺らします。インキュベーションの終わりに、0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよび3%BSAの10ミリリットルの組織を、揺れと光からの保護で摂氏37度で5時間、PBSで2回リンスする。
2回目のすすいで、新鮮な0.2%トリトンX-100の10ミリリットルで組織を洗浄した後、 10%DMSOと3%BSAとPBSを37°Cで16〜48時間振盪し、その後、0.2%トリトンX-100、10%DMSOおよびPBSの3%BSAの300マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブに組織を移し、適切な二次抗体を補い、アルミニウム箔を使用してチューブを軽く保護します。シェーカーで摂氏37度で2日間のインキュベーションを行った後、0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAの10ミリリットルで2回、光から保護された37°Cで5時間PBSで洗浄します。2回目の洗浄後、新鮮な0.2%トリトンX-100、10%DMSO、3%BSAを含むチューブに組織を洗浄し、37°Cで16〜48時間、揺れと光保護を行います。
その後、揺れと光の保護で摂氏37度でPBSの10ミリリットルだけで2時間の洗浄が行われます。PBSの終了時に白い脂肪組織を洗浄するためには、示されているように光から保護された揺れで室温で2時間の上昇送送用エタノール濃度系列の組織と10ミリリットルを浸す。翌朝、発煙フードに5ミリリットルのメチルサリチル酸を含むプラスチックキャップを持つ20ミリリットルのガラス瓶に組織を浸します。
白い脂肪組織は、この段階でまだはっきりと見えます。容器を室温で少なくとも2時間は光から守ってください。白い脂肪組織は完全に移植される。
染色され、クリアされた白い脂肪組織の3D共焦点イメージングのために、ガラス底を備えた金属イメージングチャンバーをマウントし、ヒュームフードで組織をチャンバに移す。新鮮なメチルサリチル酸塩でチャンバーを充填します。チャンバを閉じるための組織と大きなカバースリップを安定させるために小さなカバースリップを追加することにより、チャンバーのマウントを確定します。
チャンバーを低倍率で組織イメージング用の反転共焦点顕微鏡ステージに置き、脂肪組織サンプル全体の数立方センチメートルの3Dマップを生成します。3D マップの生成後、解像度と深さの間に良好な比率を提供する 20X 長距離エア目標を使用して、高い倍率で組織サンプリング用の領域を選択します。セルセグメンテーションの場合は、3Dスタックをソフトウェア形式に変換してメモリスペースを解放します。
ソフトウェアのセルモジュールを開く前に。細胞検出設定をプラズマ膜染色に変更し、細胞周辺を分化するために使用するマーカーの蛍光チャネルを選択します。次に、しきい値を設定し、予期されるセル サイズの範囲を指定して、セグメンテーションを実行します。
ヒトおよびマウス白色脂肪組織に対するクリアの影響は、肉眼で観察することができる。クリアはまた、獲得可能な組織の画像深度を大幅に向上させます。そして4Xの倍率の全体のティッシュの3Dイメージ投射および3D地図の生成を促進する。
3Dマッピングにより、20倍の倍率で2ミリメートルの深さまで、興味のあるさまざまな領域を選択できます。脂質滴および脂肪細胞の特異的染色は、それぞれペリリピンおよび抗GLUT4抗体を用いて達成することができる。血管は、犠牲の直前にCD31抗体またはレクチンDyLight 649の静脈注射のいずれかを使用して検出することができる。
マクロファージおよびT細胞は、抗CD301フィコエリスリン抗体および抗TCRベータブルー抗体を用いて可視化することができる。末梢神経ネットワークは、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体を用いて検出することができる。これらの標識を用いて、脂肪細胞の平均サイズおよびサイズ分布と脂肪組織内の血管ネットワーク密度を決定することができる。
サンプルの準備が不十分な場合は画質が良くなるため、実証されているように職業時間に従う必要があります。このプロトコルは、高度なイメージングシステムと組み合わせることができ、または後処理画像解析フリーウェアに結合することができます。
