この方法は、マウスの早期アテローム性動脈硬化症の病態生理学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、アルドステロンが成人の成長におけるアテローム性動脈硬化症プラークの発症を誘導する効率、迅速性である。この方法の視覚的なデモンストレーションは、テキストの指示だけでは、いくつかの技術的な手順を学ぶのが難しいため、重要です。
手順を実証することは、私の研究室のスタッフサイエンティスト、カテリーナ・マンミです。外科用手袋を着用し、ミニポンプ充填管を1ミリリットルのシリンジに取り付け、125マイクロリットルのアルドステロンまたは車両溶液でチューブをロードします。それ以上進めなくなるまで、ミニポンプの上部にある穴を通して充填管を挿入し、ゆっくりとアルドステロン溶液でポンプを充填します。
液体のビーズがポンプ本体から上昇したときにポンプを充填し、慎重に充填チューブを取り外します。フローレギュレータをミニポンプの本体に挿入し、レギュレータがポンプ本体に対してしっかりと播種され、充填されたポンプを37°Cで含むビーカーに入れ、移植前に最大24時間調整します。ポンプを移植するには、カミソリを使用して外科部位から毛髪を取り除き、70%イソプロピルアルコールを浸した、不織布パッド材料で露出した皮膚を消毒する。
次に、皮膚を通して0.8〜1センチメートルの切開を行いますが、下層の組織は作らず、切開に鉗子を使用します。一方、トロカールを使って皮を広げて、切開部から肩甲骨に向かってポンプ用のポケットを作り、ポンプを切開に挿入し、レギュレータの頭部をマウスの前方に向けて、ポンプを完全にポケットに押し込んで、張りや伸張をせずに傷口を閉じるのに十分な皮膚がある。ポンプが挿入されたら、切開部を手術ワイヤーで縫合し、清潔な綿棒を使用して局所的な10%ポビドンヨウ素軟膏を塗布する。
その後、マウスが完全な債務まで監視して温暖化段階で回復できるようにします。適切な実験終点では、10〜15ミリリットルの氷冷DPBSを用いた重力灌流を用いてマウスを左心室を介してパーフューズし、続いて中性緩衝液の10%の40〜50ミリリットルが続く。10~20分後、マウスをステレオ顕微鏡の下に置き、鉗子とはさみを使用して過剰な心膜脂肪組織を取り除きます。
固定心臓を鉗子で保持し、損傷を引き起こすことなく、心臓にできるだけ近い大動脈弓のアクセスに垂直に切断します。心臓が大間から分離されたら、メスを使用して直線に沿って横断的に切断し、左右の心房の下の点を結合し、開いた心の上部を最適な切断温度化合物で満たします。切除された組織を、大動脈の軸を長方形のモールドの基部に垂直に配置したクライオセクションプラスチック型で配置し、新鮮なOCTで組織を覆います。
金型をバックライトして組織が正しく向くようにし、ドライアイスの金属板に金型を慎重に置き、OCTが白くなったときにマイナス80°Cの貯蔵のために金型全体を銀箔で包みます。クライオスタットがマイナス20度に達したら、凍結した心臓ブロックを外側に向けた心室を持つ標本ホルダーに取り付け、標本ホルダーを標本オリエンティングヘッドに挿入します。大動脈根をブレードに垂直に切り離し、大動脈根に到達するまでブロックを切断するように、検体ホルダーの向きを調整します。
3つの大動脈弁がすべて現れるまで、解剖学的大動脈の根のプロフィールを監視するガラスのスライドに連続セクションを集める。その後、6〜8、10マイクロメートルの厚いセクションを収集するか、3つのバルブのいずれかが消えるか、もはや無傷になるまで。油赤O中性脂肪染色の場合は、70ミリリットルのホルムアルデヒドを5分間固定し、続いて水道水で徹底的に洗浄します。
2〜3分後、アクセス水を消し、0.3%油赤Oの70ミリリットルで10分間染色します。インキュベーションの終わりに、蛇口水でスライドを10分間洗い、マイヤーのヘマトキシリンの70ミリリットルで1分間細胞を染色し、続いて1分間の水洗浄と0.5%炭酸リチウムの70ミリリットルで1分間のエマーシオンを行います。その後、細胞を水で1分間洗浄し、光顕微鏡によるイメージング用の水性取り付け媒体でセクションを取り付けます。
4週間の治療の後、アポリポプロテイン-Eノックアウトマウスは、対照野生型動物と比較して、脂質含有量の有意な増加を示した。さらに、アルドステロン治療は、マック3染色によって証明されるようにノックアウト動物のマクロファージ含有量を増加させ、これらの動物において、処置されたマウスと比較してより炎症を起こしたアテローム硬化性プラークを示す。しかし、アルドステロン治療はアテローム硬化性プラークのコラーゲン含有量を変化させるものではない。
この手順を試みる間, この方法は、アテローム性色素を与えるときにアテローム性動脈硬化症を発症する自然に傾向があるアポリポタンパク質マウスの場合にのみ検証されることを覚えておくことが重要です..したがって、異なる動物モデルに適用することはできません。この手順に従って、他の大動脈領域におけるアテローム性動脈硬化症を特徴付け、アテローム硬化性負担の合計を定量化するために、インフラ染色のような他の方法を行うことができる。
その開発後、この技術は、アテローム性動脈硬化症の分野の研究者が炎症や内皮機能不全などのアテローム発生の初期のメカニズムを探求する道を開いた。イソファンやホルマリンなどの揮発性化合物を使用すると非常に危険であり、安全ラボのフェイスマスクを着用するなど、この手順を実行する場合は常に予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
