Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в патофизиологии раннего атеросклероза у мышей. Основным преимуществом этой техники является эффективность, быстрота, с которой альдостерон индуцирует развитие атеросклероза бляшек у взрослого роста. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку некоторые технические шаги трудно узнать только с помощью текстовой инструкции.
Демонстрацией процедуры будет Катерина Мамми, штатный ученый из моей лаборатории. Надев хирургические перчатки, прикрепите трубку для заполнения мини-насоса к одному миллилитровому шприцу и загрузите трубку 125 микролитров альдостерона или раствора транспортного средства. Вставьте трубку через отверстие в верхней части мини-насоса, пока он не может заранее не дальше и медленно заполнить насос с раствором альдостерона.
Прекратите заполнять насос, когда шарик жидкости поднимается из тела насоса и тщательно удалить трубку. Вставьте регулятор потока в корпус мини-насоса, заботясь о том, чтобы регулятор посеян плотно против тела насоса и премьер заполненный насос в стакан, содержащий стерильный солевой раствор при 37 градусах по Цельсию, в течение 24 часов до имплантации. Для имплантации насосов используйте бритву для удаления волос с хирургического участка и дезинфекции открытой кожи 70%-изопропиловым спиртом, пропитанным нетканым материалом.
Затем сделайте разрез на 0,8-1 сантиметр через кожу, но не на лежащие в его основе ткани и используйте миппы, чтобы открыть разрез. Используя трокар в другой руке, распространение кожи, чтобы создать карман для насоса от разреза к лопатке и вставить насос в разрез, с головой регулятора ориентированы на передней части мыши, осторожно толкая насос полностью в карман, так что есть достаточно кожи, чтобы закрыть рану без напряжения или растяжения. После того, как насос был вставлен, шов разрез с хирургическим проводом и использовать чистый тампон для применения актуальных, 10%povidone йод мази.
Затем позвольте мыши восстановиться на стадии потепления с мониторингом до полной лежачих. В соответствующей экспериментальной конечной точке, perfuse мыши через левый желудочек с использованием гравитации перфузии с 10 до 15 миллилитров ледяной DPBS, а затем от 40 до 50 миллилитров 10% нейтрального буфера сформулировать. Через 10-20 минут поместите мышь под стерео-микроскоп и используйте типсы и ножницы, чтобы удалить избыток периаортальной и перикардиальной жировой ткани.
Держите фиксированное сердце с типсами и вырезать перпендикулярно доступ аорты арки, как можно ближе к сердцу, не причиняя ущерба. После того, как сердце было отделено от аорты, используйте скальпель, чтобы сократить поперечно вдоль прямой линии, соединяя нижние точки правого и левого атриума и заполнить верхнюю часть открытого сердца с оптимальным соединением температуры резки. Поместите переселенную ткань с крио-секционные пластиковые формы с оси аорты размещены перпендикулярно основанию прямоугольной формы и покрыть ткани свежим OCT.
Подсветка формы, чтобы убедиться, что ткань правильно ориентирована, а затем осторожно поместить плесень на металлическую пластину на сухой лед, упаковка всей формы с серебряной фольгой для хранения минус 80 градусов по Цельсию, когда OCT становится белым. Когда криостат достигает минус 20 градусов по Цельсию, смонтировать замороженный блок сердца на держатель образца с желудочковой облицовкой наружу и вставить держатель образца в образец ориентации головы. Отрегулируйте ориентацию держателя образца на раздел блока с корнем аорты перпендикулярно лезвию и вырежьте блок до тех пор пока корень аорты не будет достиган.
Собирайте серийные секции на стеклянные горки, отслеживая анатомический профиль корня аорты, пока не появятся все три аортального клапана. Затем соберите от шести до восьми, 10 микрометров толщиной разделов или до тех пор, пока один из трех клапанов исчезает или больше не нетронутыми. Для масла красного O нейтрального жира окрашивания, исправить разделы в 70 миллилитров 37%формальдегида в течение пяти минут, а затем тщательно мыть в водопроводной воде.
Через две-три минуты, пятно от доступа воды и пятно разделов в 70 миллилитров 0,3%масло красного O в течение 10 минут. В конце инкубации, мыть горки в водопроводной воде в течение 10 минут и пятно клеток в течение одной минуты в 70 миллилитров гематоксилина Мейера, а затем одну минуту мытья воды и одну минуту эмерации в 70 миллилитров 0,5%lithium карбоната. Затем мыть клетки в воде в течение одной последней минуты и смонтировать разделы с aqueous монтажа среды для визуализации с помощью световой микроскопии.
После четырех недель лечения, аполипопротеин-E нокаут мышей отображается значительное увеличение содержания липидов, по сравнению с контрольно-диких животных типа. Кроме того, лечение альдостерона увеличивает содержание макрофагов в нокаут животных, о чем свидетельствует Мак-3 окрашивания и указывая на более воспаленной атеросклеротической бляшки у этих животных по сравнению с транспортным средством лечение мышей. Однако лечение альдостерона не изменяет содержание коллагена в атеросклеротических бляшках.
При попытке этой процедуры, важно помнить, что этот метод проверяется только для аполипопротеинов мышей, которые, естественно, склонны к развитию атеросклероза при кормлении атерогенного красителя. Таким образом, он не может быть применен к различным моделям животных. Следуя этой процедуре, другие методы, такие как инфракрасное окрашивание могут быть выполнены для характеристики атеросклероза в других аортальных областях и количественно общей атеросклеротической нагрузки.
После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области атеросклероза, чтобы исследовать ранний механизм атеросклероза, таких как воспаление и эндотелиальной дисфункции. Не забывайте, что работа с летучими соединениями, такими как изофан и формалин может быть чрезвычайно опасным, и что меры предосторожности, такие как ношение маски безопасности лаборатории лица всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры.
