この方法は、アミノ工学分野の主要な質問に答える助けになります。例えば、生体物質免疫細胞相互作用および活性化に対する粒子物性の役割は何である。この技術の主な利点は、バイオミメティック粒子のサイズと形状の独立した制御を可能にすることです。
この技術の意味は、生体細胞介在免疫応答を引き起こす可能性のある既製粒子療法であるため、癌の治療にまで及ぶ。この方法は、癌のアミノ療法への洞察を提供することができますが, 他のシステムにも適用することができます。.例えば、感染症や1型糖尿病。
微粒子合成の場合、まず、100ミリグラムのポリ(乳酸-コグリコール酸)またはPLGAをシンチレーションバイアルに計量し、渦を起こして5ミリリットルのジクロロメタンにPLGAを溶解させます。50ミリリットルの1%ポリビニルアルコール、またはPVA溶液を含むビーカーにホモジナイザーを入れて、ホモジナイザーがビーカーの底にできるだけ近く触れることなく近づくようにします。適切な速度にホモジナイザーをオンにし、均質化の1分間ビーカーにPLGA溶液を追加します。
均質化の終わりに、ポリビニルアルコールPLGA微粒子溶液を化学フードの攪拌板に100ミリリットルの5%PVA溶液を含むビーカーに注ぎ、少なくとも4時間攪拌します。溶媒が蒸発したら、粒子溶液を50ミリリットルの円錐形チューブに注ぎ、遠心分離によって粒子を集める。各チューブ内の上澄み物を20ミリリットルの脱イオン水に置き換え、渦によって粒子を再懸濁させます。
その後、各チューブの最終体積を新鮮な脱イオン水で最大50ミリリットルにし、実証したように粒子をさらに2回洗います。ナノ粒子合成の場合、5ミリリットルのジクロロメタンにPLGAの200ミリグラムを溶解し、ビーカーの底部に触れることなく氷上に1%PVA溶液の50ミリリットルを含むビーカーに超音波処理器プローブを配置します。12ワットで超音波処理を開始し、すぐに約200ナノメートルの直径を持つナノ粒子を生成するために2分間の超音波処理のためにビーカーにPLGA溶液を追加します。
超音波処理の後、化学ヒュームフード内の溶媒蒸発の4時間の攪拌板上の5 PVA溶液の100ミリリットルを含むビーカーに1%ポリビニルアルコールPLGAナノ粒子溶液を注ぎます。すべての溶媒が蒸発したら、粒子溶液を50ミリリットルの円錐チューブに注ぎ、微小粒子を除去し、上清を除去します。次に、ナノ粒子を高速遠心管に移し、実証したように脱イオン水で3回のスリングを行います。
ポリマー粒子製造の場合、最後の洗浄後、粒子を約1ミリリットルの新鮮な脱イオン水で再懸濁し、1ミリリットルの粒子の最終濃度にフィルム鋳造液を加える。1次元延伸のために75 x 50ミリメートルの長方形のペトリ皿に10ミリリットルのアリコートで粒子懸濁液を移す。または15ミリリットルのアリコートで100〜100ミリメートル平方のペトリ皿に2次元ストレッチ。
化学フードで一晩乾燥した後、ピンセットを使用してフィルムを取り除き、はさみで縁を整えます。1D延伸の場合、1つのフィルムの2つの短いエッジをネオプレンゴムの2つの部分の間に置き、自動薄膜伸縮装置の1軸のアルミニウムブロックに取り付けます。その後、アレンレンチを使用して、ゴムの上の金属グリップをねじ込んでフィルムを所定の位置に保持します。
2Dストレッチの場合、4つのエッジすべてを4つのアルミニウムブロックに取り付けて、両方の軸でフィルムを伸ばし、1つのDストレッチのアルミニウムブロック間のフィルムの長さを記録し、2Dストレッチの場合は1つまたは両方の軸を記録し、所望の折りたたみストレッチに基づいてフィルムを1つまたは2つの方向に伸ばすために必要な距離を計算します。その後、フィルムをオーブンに積み込んだストレッチ装置を摂氏90度のオーブンに置き、少量の水の大きなビーカーの隣に置き、フィルムを10分以上温度にします。延伸が完了したら、フィルムを室温まで20分間冷まします。
1Dストレッチの場合は、フィルムを伸張装置の端から切り取ります。2Dストレッチの場合は、両方の軸で均一に伸ばされたフィルムの中心の正方形を切り取って保存します。フィルムをチューブあたり2本以下のフィルムを持つ50ミリリットルの円錐管に入れ、渦を出すために各チューブに約25ミリリットルの脱イオン水を加えます。
フィルムが溶解したら、実演したように粒子を脱イオン水で3回洗浄する。最後の洗浄後、チューブあたり約1ミリリットルの新鮮な脱イオン水で粒子を再懸濁する。その後、1時間または一晩凍結乾燥のためにマイナス80度で粒子を凍結します。
翌朝、凍結乾燥したマイクロまたはナノ粒子を、渦を伴って調製した新しいMESバッファーで1ミリリットル当たり20ミリグラムで再中断する。900マイクロリットルのMESバッファーを含むポリプロピレンマイクロ遠心分離管に100マイクロリットルの粒子溶液を加え、100マイクロリットルの新たに調製したEDC NHS溶液を加えます。粒子を渦で混ぜ、室温でインバータ上の粒子を30分間インキュベートします。
インキュベーションの終わりに、遠心分離によって粒子を収集し、2〜3ワットで5秒の超音波処理によってPBSの1ミリリットルで微粒子ペレットを再懸濁するか、または再懸濁する。次に、1つのタンパク質と10マイクログラムの抗マウスCD28抗体の適切なシグナルの8マイクログラムをマイクロ粒子に加え、1タンパク質のシグナル16マイクログラムと抗マウスCD28の20マイクログラムをナノ粒子に加えます。各チューブの最終体積をPBSで1.1ミリリットルにし、摂氏4度でインバーターで一晩粒子をインキュベートします。
翌日、デモンストレーションのように粒子を脱イオン水で3回洗浄します。これらのPLGAナノおよびマイクロ粒子は、透過および走査電子顕微鏡を用いて実証および画像化された単一のエマルジョン技術を用いて合成した。均質化後、マイクロ粒子は約3マイクロメートルの平均直径を実証した。
球状の微粒子は約1のアスペクト配給を持ち、1D伸びた楕円体粒子は約3.5の大きなアスペクト比を持ち、2D伸ばした楕円体粒子は約1.2のアスペクト比を持ち、アスペクト比は1の大まかに維持した。結合効率の結果は、球状および楕円体のマイクロ人工抗原提示細胞、またはAAPCおよびナノAAPCの表面上の類似量のタンパク質を明らかにし、AAPC合成中のタンパク質結合が濃度依存的に起こることを実証する。プロレート楕円体AAPCは、01ミリグラムの用量で達成された最良の分離を有する球形AAPCよりもサブ飽和用量で高いレベルのT細胞増殖を誘導することが判明した。
7日後、T細胞の手動カウントは、楕円体AAPCがより効果的に用量依存的な方法でマイクロおよびナノスケールで彼らの球形の対応物と比較してT細胞を刺激することを明らかにした。この手順に従って、 AAPC は、治療効果および薬物動態を測定する in vivo で管理することができます。.その開発後、この技術は、免疫工学の分野の研究者がAAPC有効性に対する異方性の影響を探求する道を開くのに役立ちました。
