非刺激性ペプチドMHC複合体はT細胞を活性化しないが、アゴニストペプチドMHCに対するT細胞応答を増強することができる。このプロトコルは、ヒトCD8 T細胞活性化中の共アゴニズムを調査する実験システムを記述する。MHC分子を、共有結合重鎖、β-2-ミクログロブリン、ペプチドを持つ単鎖複合体として発現します。
これにより、所定のペプチドを提示するMHC分子に変異を導入することができる。このプロトコルは、B型肝炎ウイルスのエピトープに特異的なヒトCTNクローンを使用する。肝炎に対するT細胞応答中の共アゴニズムのメカニズムを理解することは、このウイルス感染に対する免疫性刺激薬の開発に寄与する可能性がある。
提示された方法は、既知のペプチドMHC特異性を有するヒトT細胞系におけるT細胞活性化の研究および他の基本的な側面に使用することができる。このプロトコルは、シグナル配列、目的とするペプチド、リンカー、ヒトβ-2-ミクログロブリンリンカー、およびMHC重鎖からなる単鎖ヒトMHCクラスI分子を使用する。B型肝炎由来のE1A3ペプチドはアゴニストペプチドとして使用される。
HIVからのギャグは、非刺激ペプチドとして使用されます。単鎖ヒトMHC分子は、テトラサイクリンリプレッサーを含むハムスター細胞株で発現する。アゴニスト単鎖MHCはテトラサイクリン誘導性プラスミドを用いて発現し、テトラサイクリンの存在下では発現量が非常に低く、かつテトラサイクリンの存在下で高発現レベルを生じる。
低レベルのアゴニストペプチドMHCを発現するCHO細胞は、構成的に非刺激性ペプチドMHCをトランスフェクトする。この実験システムの使用により、非刺激ペプチドMHCの存在下または非存在下でのアゴニストペプチドMHCに対するT細胞応答を比較することができる。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、T-75フラスコでCHO細胞を培養します。
T細胞活性化実験の前日に、フラスコ中の細胞をPBSで洗浄する。PBSに05%トリプシンと2%EDTAを含む溶液を加え、室温で5~10分間インキュベートします。軽い顕微鏡を使って、細胞が切れ目が切れしていることを確かめる。
次に、フラスコに完全なF12を加えてトリプシン化を停止します。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。400Gで5分間遠心分離機を使用し、ピペットまたはデカントで上清を除去します。
完全なF12の5ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、CF12で細胞濃度を1ミリリットル当たり200,000細胞に調整します。テトラサイクリン1ミリリットル当たり50~60ナノグラムをアゴニストのみのサンプルに加え、陽性対照として大量のアゴニストpMHCクラスI発現を誘導する。
この後、CHO細胞をボルテックスまたはピペットで混合します。U-底96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液の100マイクロリットルを追加します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベート。
実験の前日、遠心分離機CTLS細胞はGの400倍、摂氏4度で5分間である。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、サイトカインやPHAを使用せずに完全なヒトT細胞培地で1ミリリットル当たり100万個の細胞の密度で再中断します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩CTLをインキュベートする。
翌日、T細胞をGの400倍、摂氏4度で5分間遠心分離する。上清を捨て、2ミリリットルの完全な無血清培地で細胞を再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用してT細胞を数え、完全なヒトT細胞培地で1ミリリットル当たり100万個の生細胞に密度を調整します。
抗ヒトCD107a抗体を1~100希釈で、ブレフェルディンAを1~1000希釈で添加する。次に、CHO細胞を含む96ウェルプレートを回収する。ガラスパスツールピペットを使用して、CHO細胞から培地を吸引する。
T細胞懸濁液の200マイクロリットルを各ウェルに加えます。T細胞を37°CでCHO細胞と共培養し、5%の二酸化炭素を3〜4時間共存させた。コカルチャーの終わりに、96ウェルプレートをG400倍、摂氏4度で5分間遠心分離する。
吸引またはフリックして上清を取り除く。次に、2.5マイクロリットルのCD3抗体と2.5マイクロリットルのCD8抗体をPBSの50マイクロリットルの5%BSAに各ウェルに加え、細胞表面抗原染色のために、ピペット処理によって混合する。サンプルを暗闇の中で、氷の上で30分間インキュベートします。
この後、各ウェルに150マイクロリットルの洗浄バッファーを加えてサンプルを洗浄します。サンプルをGの400倍、摂氏4度で5分間遠心する。吸引またはフリックして上清を取り除く。
固定/透過性キットをセットし、各ウェルに100マイクロリットルの固定/透過性溶液を加え、混合するピペットを加えます。氷の上で20分間インキュベートします。その後、プレートを摂氏4度で400倍Gで5分間遠心する。
上清を捨て、各ウェルに1Xパーマ/ウォッシュバッファの200マイクロリットルを追加します。遠心からパーマ/ウォッシュバッファを1回追加して、このプロセスを繰り返します。この後、抗インターフェロンガンマを含むパーマ/ウォッシュバッファーの50マイクロリットルで、1ミリリットル当たり3マイクログラムの濃度で細胞を再懸濁します。
暗闇の中で氷の上で30分間インキュベートします。次に、1Xパーマ/ウォッシュバッファの150マイクロリットルを加えます。400G、摂氏4度の遠心分離機、5分間。
上清を取り除き、1Xパーマ/ウォッシュバッファの200マイクロリットルを追加します。400倍G、摂氏4度で再びプレートを5分間遠心し、吸引またはフリックして上清を取り除きます。200マイクロリットルの洗浄バッファーでサンプルを再中断し、細胞測定分析を進めます。
実験の1日前に、CHO細胞をボルテックスまたはピペットで混合します。次に、12ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を1ミリリットル加えます。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベート。
実験当日は、セルスクレーパーを使用してCHOセルを各ウェルの底部から取り外します。各ウェルからFACSチューブに細胞を含む培地の1ミリリットルを移す。400倍Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。
洗浄バッファーに希釈した抗 HLA 抗体の 100 マイクロリットルで再中断します。氷の上で30分間インキュベートします。次に、各CHOサンプルに1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。
400倍Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間、上清を捨てます。各サンプルを3ミリリットルの洗浄バッファーに再中断し、フローサイトメトリー分析に進みます。本研究では、ヒトCD8陽性T細胞活性化中の分子相互作用の研究のための堅牢なツールが提示される。
共アゴニストpMHCの存在下または不在で低レベルのアゴニストpMHCを提示する、設計された異種システムが生成される。これらの設計されたAPCはE183特異的ヒトCD8陽性T細胞クローンを刺激するために使用される。非感染CHO細胞、および非刺激性単鎖Gag-MHC複合体を発現するCHO細胞は活性化を誘導しない。
陽性対照であるアゴニスト単鎖E183-MHC複合体の高レベルの発現は、非常に効率的なインターフェロン-γ産生を誘導し、脱顆粒化することが見られ、単鎖E183構築物がT細胞エフェクター機能を活性化するために特定のTCRによって認識できることを実証する。シングルチェーンE183-MHC複合体の低レベルの発現は、非刺激性Gag-MHC複合体の存在によって増強されたインターフェロンガンマ産生および脱顆粒の低レベルを誘導する。なお、CD107a+T細胞の割合は、低レベルの抗原pMHCに応答しても観察されており、これは以前の研究と一致している。
しかし、非刺激性Gag-MHC複合体の存在は、CD107a MFIを増加させる。この手順の間、非刺激ペプチドの有無にかかわらず等しいアゴニストの提示を確実にするために、アゴニストペプチドMHC発現を制御することが重要である。各実験においてTCR様抗体を用いてアゴニストペプチドMHC発現を定量化することが重要です。
代替アプローチは、支持された脂質二重層、またはビーズを用い、非刺激ペプチドMHCの存在下で一定量のアゴニストペプチドMHCを提示する。これらの実験システムは、共アゴニズムのための複数の非刺激ペプチド配列のテストを可能にする必要があります。単鎖MHC技術はCD4 T細胞活性化における分子相互作用を調べるとともに、非古典的なMHC分子を調べるのに使用することができる。
このプロトコルは、人間の血液とヒト細胞を使用しています。血液媒介性疾患の伝染のリスクを減らすために人間の血液を扱うときに必要なすべての予防措置に従ってください。
