Name: ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer at JoVE.com

私たちは、携帯アプリケーションについて実りある議論を継続するためローランLimozin、ピエール・ディラードとアストリッド・ワル感謝します。また、SEM観察と彼の助けをPLANETEのクリーンルーム施設からフレデリック・ベドゥ感謝します。この作品は、部分的に助成金番号307104 FP / 2007から2013 / ERC経由の欧州研究評議会によって資金を供給されました。

1.クリーニングガラスカバー・スライドと観察室<ol><li>ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）のような不活性材料で作られたマルチスライドトレイ上のガラスカバースライドを配置。 </li><li>界面活性剤溶液中にスライドを有するトレイと観察室（適切である石英キュベットを洗浄するために推奨される任意の製品）を浸します。 </li><li> （20と30℃の間）、室温で30分間、界面活性剤溶液中で超音波浴、超音波処理を使用して。 </li><li>超純水で5回（18.2MΩ.cm、0.059μS/ cm）をすすぎます。 </li><li> （20と30℃の間）、室温で30分間、界面活性剤溶液中の超音波処理。 </li><li>超純水で10回洗浄します。 </li><li>繰り返しは二回1.5と1.6を繰り返します。 </li><li>最大1週間（20〜30°Cの間）、室温で水に保管してください。 </li></ol>タンパク質ナノドットの2製作<ol><li>ビーズの沈着<ol><li> Deposiシリカビーズ（2％v / v、70μL）の懸濁液tを15度の傾斜で保持カバースライド（24×24ミリメートル、厚さ170ミクロン）に一滴ずつ。 </li><li> 90°ごとに15秒でガラスを反転しながら、約1分間のサスペンション広がりをしてみましょう。 </li><li>液体は、周囲条件下で蒸発することを許可します。 </li><li>最大2日間周囲条件で清浄なガラスまたはPTFE室に保管してください。 </li></ol></li><li>アルミの蒸着<ol><li>シリコン（1％）ターゲット：アルミニウム（99％）から約105ミリの間隔で回転テーブル上に、マグネトロンスパッタリング装置8（RF）無線周波数内部（セクション2.1で調製）スライドを置きます。 </li><li>ターボ分子ポンプを用いて2.6×10 -4 Paまで堆積チャンバをポンプダウン。このステップでは、可能なガス状不純物の除去のために重要です。 </li><li> 0.8 PA（6.6ミリトール）の圧力で10sccmの束と純アルゴン雰囲気（5N、99.999％）を導入。 <br/&gt;注：着信アルゴンフラックスはマスフローコントローラによって制御され、プロセス圧力が圧力計を用いて監視されます。アルゴンガスの流れは連続的であり、バルブを開く入口と出口との間のバランスによって制御されます。 </li><li> RF電力発生器のスイッチをオンにします。 注記：ここでは、13.56MHzの周波数で400〜600 Wの高周波電力の典型的な範囲を使用しました。 RF発生器は、容量性プラズマ結合モードにおける整合ネットワークと共に使用されます。反射電力を監視し、ネットワークの適応を使用して最小化されます。 </li><li>プラズマが安定した後、シャッターを保持する2分間スパッタリングターゲットの表面から可能な不純物を除去するために閉じ。 </li><li>シャッターを開き、スパッタリングが200nmの厚さのガラススライド上にアルミニウムを堆積させるために60分間継続することを可能にします。 </li><li>堆積室からターボ分子ポンプを分離し、清浄なNでチャンバを通気するゲートバルブを閉じ、アルゴンの流れをカット部屋の圧力を得ることがitrogen。アルミニウム被覆スライドを回復します。月までの周囲条件下で、清潔で密閉されたガラスやPTFEボックス内のために保管してください。 </li></ol></li><li>有機シランの蒸着<ol><li> （20と30℃の間、50 W、50/60 Hz）で室温超音波浴中で30秒間超音波処理で超純水にステップ2.2.6で調製したアルミニウム被覆スライドを浸します。 </li><li>デポジットデシケーターの底部の（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）の0.5 mLです。 注意：APTESを容易に蒸発し、有毒であるオルガノシランです。 APTESは、フローフードの下と手袋で処理する必要があります。 </li><li>デシケータ内部セラミックグリッド及び場所に（2.3.1で調製）ガラススライドを置きます。 </li><li>膜ポンプにデシケーターを接続し、低真空を生成するために30分間、最大パワーで動作。 </li><li>デシケーターのバルブを閉じ、ポンプのスイッチを切ります。 </li><li>デシケーターを熱し1時間約50℃です。 </li><li>デシケーターを開き、スライドを集めます。 </li><li>室温（20℃〜30℃）で最大48時間保存のために別の清浄なデシケーターに移します。 </li></ol></li><li>タンパク質の第一の層の堆積 - ビオチンで標識したウシ血清アルブミン（BSAビオチン） <ol><li> PTFE支持体上のセクション2.3で調製されたスライドの1を置きます。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解を25μg/ mLのBSAビオチンの預金1 mLです。室温（20〜30℃）で30分間放置します。 </li><li> PBSで10回洗浄します。光源から離れて4℃で最大24時間、サンプルを保存します。 </li></ol></li><li>アルミニウムマスクの除去<ol><li> （20と30℃の間）を、室温でオーバーナイト（pH≈12を得るために、約100 mLのPBSに1 M NaOHを滴下することにより調製）PBS中のNaOHの溶液でスライドをインキュベートします。 注意。 NaOHが腐食性であり、手袋を使用して処理されなければなりません。 </li><li>リンス超純水で10倍。 </li></ol></li></ol>サポートされている脂質二重層の3堆積（SLB） <ol><li>ラングミュアトラフのクリーニング<ol><li>ポンプを使用してラングミュアトラフのPTFEの筐体に水を除去します。 </li><li>クロロホルムに浸したリントフリー不織布使い捨てタオルできれいにします。 注意。クロロホルムは有毒であり、マスク（またはフローフード下）で、適切な手袋で、よく換気された場所で操作しなければなりません。 </li><li>ぬるま湯超純水できれいに4回（40〜50゜C）。 </li><li>冷たい超純水で少なくとも6回を清掃してください。 </li></ol></li><li>第1の脂質層の堆積<ol><li>ラングミュアトラフのPTFEの筐体にPTFEトレイを置き、その後、超純水でそれを埋めます。 </li><li> 0 MN / mで測定された圧力を設定するためにラングミュア装置の制御ソフトウェアを使用します。 </li><li> （1mg / mlの脂質溶液30μLを堆積するために1を気密ガラス/金属シリンジを使用クロロホルム中、2- dioleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DOPC））水の表面に。クロロホルムを蒸発し、脂質分子が自発的に単層を形成します。 </li><li>到達する（DOPC 27のMN / m）の所望の圧力までPTFEバリアを閉じることにより、脂質単層を圧縮するために制御ソフトウェアを使用。 </li><li>電動式クランプを使用して、PTFEエンクロージャにセクション2.5.2で調製したスライドガラスを浸漬する制御ソフトウェアを使用。 </li><li>空気 - 水界面に垂直なクランプで、スライドを保持します。 27のMN / mにおける一定の圧力を維持しながら、インタフェースを介してゆっくり（15ミリメートル/分）を上昇させる制御ソフトウェアを使用。 </li><li>即時使用のいずれかまたは（20と30℃の間）を室温で24時間までの貯蔵のために乾燥した環境内の場所。 </li></ol></li><li>第2の脂質層の堆積<ol><li> 27のMN / Mの所望の値にラングミュアトラフにおける面圧を維持します。使用して圧縮制御ラングミュア装置のソフトウェア及び/又は所望の圧力を達成するために、脂質を少量加えます。 </li><li>水平に水の表面上に、セクション3.2.6で調製した脂質単層を担持するスライドガラスを置き。各スライドは、PTFEトレイの上に浮いていることを確認してください。 </li><li>ダウンガラススライドを押し、それらが水に浸漬されるように、PTFE又は金属ピンセットを用いて、その対応するPTFEトレイに一度にスライド。押しながらスライドを傾けないでください。 </li><li>超純水は、スライドが空気にさらされていないことを確認することで満たさ晶析にスライドを含むPTFEトレーを転送するためにPTFEや金属ピンセットを使用してください。 </li><li>観察室に、二重層コーティングされたガラススライドを水中作業中に、転送するためにPTFE又は金属ピンセットを使用します。 注：観測室が晶析装置内の水の下に配置されます。観察室は、カスタムメイド、ゴムガスケットANとPTFEリングから構成されていますその底面以前に脂質二重層でコーティングされたスライドガラスから作られて水密容器を製造するために水中で組み立てることができるD鋼ケーシング、。 </li><li>水の下で動作を続け、水約1mlをチャンバ内に閉じ込められていることを保証しながら、チャンバを閉じます。 </li><li>水の中から組み立て室を取ります。それは水を通さないと、漏れがないことを確認してください。 </li><li> PBSで観察室に超純水存在1mLの10倍を添加し、500μlのPBSを除去することによって置き換えます。チャンバーは、液体の決して欠いていることを確認してください。 </li></ol></li><li> SLBブロッキング工程<ol><li>スライドセクション3.3.6で調製し（20と30℃の間）を、室温で30分間インキュベートを含む観察室にウシ血清アルブミン（BSA）の100μg/ mLのを導入します。 </li><li>除去し、PBS 10倍の500μLを添加することによって二重層をすすぎます。二重層は、4℃で24時間維持することができます。 </li></ol></li></ol>リガンド4.機能化<ol><li> 20と30°の間（室温で30分間セクション3.4.2で調製したスライドを含むチャンバ内を2μg/ mLの蛍光性または非蛍光ニュートラビジン（NAV、pH7で充電されていないアビジンの脱グリコシル化されたバージョン）を追加C）。 </li><li> 10回添加し、500μlのPBSを除去することによってリンス。 </li><li>セクション3.4.2で調製したスライドを含むチャンバーに2μgの/ mLのビオチン化抗CD3を加えます。 SLBドットの二重官能化のため、（ここで、二重層はニトリロ三酢酸（NTA）脂質+ 1％DOPCで作られている）を5μg/ mLでのFc-ICAM1 Hisタグを追加します。 （20と30℃の間）を室温で30分間放置。 </li><li> 10回添加し、500μlのPBSを除去することにより、リンス</li><li> 10回の細胞培地の500μLを添加して除去することによって、細胞培地（PBS + 0.1％BSA）を含むPBSを置き換えます。 </li><li> chambeに細胞培地の200μLを残しますスライドでrを。 </li><li>細胞を添加する前に37°Cで10分間チャンバを置きます。 </li></ol>前記細胞堆積（詳細は文献7を参照されたいです） <ol><li>注意深くチャンバー内に細胞懸濁液400μLを堆積させます。 37℃で30分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 37°Cで15分間パラホルムアルデヒドの2％（PFA）で細胞を固定します。繰り返し除去し、PBSの500μLを添加することによってPBSでPFAを交換してください。 </li></ol> 6.観察<ol><li>プロテオ脂質ナノパターンとSLB流動<ol><li> 例えば、ここで適切な照明波長（639 nm）をフィルタキューブ（EX TBP 483 + 564 + 642を用いて画像を落射蛍光モードでのタンパク質パターンを蛍光顕微鏡を使用して、BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688）。 注：信号の強度は、ドットの内側と外側のタンパク質の量を推定するために定量化することができます。適切な照明波長（330 nm）を使用してF画像ILTERキューブ暗い穴を有する明るく見える二重層（BP 12分の365、FT 395、LP 397）。 </li><li>二重層におけるトレーサー脂質の拡散定数を測定するために、連続的な光退色（CPB）技術13、15を使用します。この観察は、好ましくは、ちょうどSLBの堆積後に行われています。 注：拡散定数を定量化するために、2つのパラメータは、CPBプロセス中に測定される：染料（緊張状態）と漂白領域（TAUD）の周囲に形成されたハローの蛍光プロファイルの減衰長の特定の漂白時間。第一は、CPBプロセス中に照明視野の中心での蛍光強度の時間変化をプロットしたものです。第二は、（定常状態に達した後12行と5枚の画像にわたって平均）照射ゾーンのエッジに強度プロファイルをプロットしたものです。曲線は、タウトとTAUDを取得するために取り付けられています。拡散定数は、TAによって与えられます。UD 2 /タウト（D = <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ）。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster.">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immunological+Synapse:+A+Molecular+Machine+Controlling+T+Cell+Activation.">The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation.</a> Science. 285, 221-228 (1999).</li><li>Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-mediated+friction+determines+morphodynamics+of+spreading+T+cells.">Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells.</a> Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+viral+antigen+processing+generates+peptide-specific+MHC+class+I+cell-surface+clusters.">Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).</li><li>Pi, F., Dillard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Tunable+Organic+Nanodot+Arrays:+A+Versatile+Platform+for+Manipulating+and+Imaging+Cells.">Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells.</a> Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).</li><li>Deeg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation+is+determined+by+the+number+of+presented+antigens.">T cell activation is determined by the number of presented antigens.</a> Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).</li><li>Delcassian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+ligand+spacing+influences+receptor+triggering+in+T+cells+and+NK+cells.">Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells.</a> Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).</li><li>Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays.">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li><li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization.">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li><li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies.">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li><li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+intermembrane+distance:+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion.">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li><li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+tissue+surfaces+by+supported+membrane+coupled+ultra-thin+layer+of+hyaluronic+acid.">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li><li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography.">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li><li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+ordered+topographical+and+chemical+nano-features+from+anodic+alumina+templates.">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li><li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion.">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands.">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level.">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li><li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse.">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li><li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters.">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li><li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation.">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398 (2012).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

上述のプロトコル内の重要なステップは、サポートされている脂質二重層によってタンパク質ナノドットまたはドットの周囲の空間の背面充填の形成に関連しています。タンパク質ナノドットに対する第1の重要なステップは、ビーズ、マスクの製造です。カバースライドの洗浄が重要です。スライドはいずれか、または酸素プラズマで石英キュベットを洗浄するために推奨される洗剤液で洗浄する必要があります。エタノールまたはイソプロパノールの治療への浸漬のような他の洗浄技術は、十分に親水性のガラスをレンダリングしていないため、大カバレッジビーズ単層の形成をサポートしていません。これと同時に、スライドの表面は、ラングミュア-ブロジェット技術7、15、16によってSLBの形成後の工程との互換性が必要です。次の重要なステップはの堆積と除去でありますluminum。堆積は、スパッタリング法によるものである場合、ここで行ったように、ターゲットは、（1％）のシリコンでドープするべきです。ターゲットは、純アルミニウムで作られている場合、おそらく酸化アルミニウム及びアルミ蒸着層とガラススライド基板との間の相互浸透を形成する、上記のようにそうでなければ、堆積層は、水酸化アルカリ溶液で除去することは困難です。堆積の期間は9が 、しかし、ここで我々は、単一の堆積時間、したがって、単一のドットサイズで働いているタンパク質のドットのサイズを決定します。サンプルは、アルミニウム蒸着後BSA-ビオチンの堆積後約一週間、数ヶ月間、周囲条件下で保存することができます。 第二の重要なステップは、SLBの堆積に関するものです。ガラスカバースライドの清掃は再び決定的に重要なポイントです。任意のラングミュア - ブロジェット堆積作業の場合のように、使用される全ての材料は、ガラス又はPOで作られるべきですlytetrafluoroethylene（PTFE）と綿密にきれいにする必要があります。第1の脂質単分子膜を堆積した後、カバースライドは数日間保存することができるが、第2単分子膜を堆積した後、彼らはすぐに使用する必要があります。 我々はTリンパ球接着研究において使用するための抗CD3ナノドットを作成するためのプロトコルを示しているが9、13、手順は非常に柔軟であり、任意のビオチン化タンパク質のために適合させることができます。脂質二重層の組成を容易に変更することができ、所望であれば、それはさらに官能化することができます。考慮すべき1つの重要な点は、特にドットを囲む脂質二重層に、タンパク質の可能性非特異的吸収です。 技術の主な限界は、一次マスクのコロイド - ビーズの自己アセンブリの使用から生じます。ボトムアップ手法なので、それはすべて、このようなアプローチの問題のいくつかを共有します例えば、柔軟性及びパターン形状を完全に制御の欠如。パターン格子は必ずしもビーズマスクの対称性を反映しているため、常に六角形です。パターンモチーフの形状は円形であり、ビーズサイズ及びアルミニウム蒸着9、13の持続時間の組み合わせによって決定されます。ドットサイズを制御するための代替技術も14、17、18が提案されています。 タンパク質、タンパク質断片またはペプチドと基板のナノパターンが広範囲の細胞表面相互作用、特に接着19及びマイグレーション20をプローブするために過去に使用されてきました。先駆的な仕事は、組織形成細胞が所与の閾値21よりも大きいピッチ、さらに調査翔とパターン上に塗布することができないことを示しています<html>この現象の長さスケールが22細胞骨格アクチンにインテグリン受容体を連結することに尽力しているtalinsのサイズによって設定されることを結婚。しかし、すべてのこれらの研究では、タンパク質は、自身がガラス上に固定化した金ナノ粒子に結合させました。 典型的には、抗原提示細胞を模倣するT細胞、プロテオ脂質膜の文脈では、広範囲T細胞機能6の基本的な側面を理解するために使用されてきました。独創的なナノパターニング技術はT細胞/ APCインタフェース23の構造および接続性への洞察を提供しているタンパク質官能SLBパッチを分離する金属バリアを有する囲いを作成するために使用されてきました。ナノパターニングのこの種のは、しかし、ここで提案したタンパク質ナノドットとは非常に異なっています。最近では、ナノクラスターは、タンパク質の官能脂質の化学結合を使用して作成されました受容体クラスタリングの結果に光を当てるSS =「外部参照」&gt; 3、。利点は、本発明の場合とは異なり、クラスタは原則的に、モバイル自身かもしれない、ということでした。しかしながら、そのような自然に形成されたクラスタは、必ずしもあまりここで説明する予備形成されたタンパク質ナノドットよりサイズ及び密度の点で制御されます。 我々は、ナノドット飾らのSLBは、ここで紹介するタンパク質が細胞間接着の異なる側面を調査するために使用することができることを想定しています。生じる1つの明らかな問題は、組織は、セル19を形成するための上述したように、リンパ球があまりにも接着に関連した固有の長さスケールを有するかどうかです。予備的な結果は、12、11、密着性TCR複合体によって媒介されるときに、少なくとも、むしろ間隔よりもリガンドの密度は、拡散および活性化10のために定義するパラメータであることを示しているように見えます<suP&gt;、13。この観察周囲SLBの影響で移動するリガンドを含めるかどうか、およびどのようにモバイルと不動画分を一緒に働くことは、部分的に自己組織化SLB結合クラスタ24を用いて対処された問題が可能です。別の興味深いアプリケーションは、メカノセンシングモバイルおよび固定化リガンド上の細胞接着/活性化T細胞7、25のためにだけでなく、習慣的に細胞外マトリックス26に付着した細胞のみならず、異なることが示されたのコンテキストであろう。 これらのプロテオ脂質パターンの2つの主な利点は、高度な光学顕微鏡と利用と投アプリケーションに適合させる準備の容易さと基板の互換性です。アルミ蒸着に続き、すべての準備手順は、標準的なウェットラボのベンチで行うことができ、。将来的には、アルミニウムで被覆された専門施設で製造されたガラス支持ビーズマスクを転送して記憶された生物学実験室で使用するためのように、必要に応じていることを想定することができます。ビューにこれで、私たちは、これらの基板が制御ナノパターニングされたプロテオ脂質膜と細胞の相互作用を研究するための最適なプラットフォームになる可能性を秘めていると信じています。

<html>細胞接着は、細胞外マトリックス上で、または別の細胞上のそれらの対応物に結合することができる細胞膜上に存在する特殊な細胞接着分子（CAM）、タンパク質を介して行われます。接着した細胞に、ユビキタスインテグリンおよびカドヘリンを含むほとんどの接着分子は、クラスター1の形態で見出されます。多くの場合、免疫学的シナプスと呼ばれる - 抗原提示細胞（APC）とTリンパ球（T細胞）の相互作用は、二つのセルの間の界面に形成された受容体クラスターの重要性の特に顕著な図を提供します。プラットフォーム2をシグナルとして働くT細胞形態ミクロンスケールクラスターの表面上のAPC、T細胞受容体（TCR）との最初のコンタクトを形成する際に、3、4、および最終的には大きな中央超分子クラスターを形成するために集中している（CSMAC ）LASS = &quot;外部参照&quot;&gt; 5、6、7。最近、APC側に、TCRのリガンドはまた、8クラスタ化されることが示されました。 T細胞-APC相互作用の文脈では、APCは、関連するタンパク質で官能人工表面によって模倣されたハイブリッドシステムの展開は、非常にシナプスインタフェース2、3、4、5、6、7の我々の理解が進んでいます。この文脈では、標的細胞の1つのまたは複数の態様を捕捉APC模倣表面を設計することが非常に適切です。リガンドが支持された脂質二重層上にグラフトされた場合、彼らは、二重層の面内に拡散するAPC表面上の状況を模倣すると同時に、の形成を可能にすることができますCSMAC 6、7。同様に、APC上のクラスターはポリマー9、10、11、12、13、14の海でのリガンドのアイランドを作成することによって模倣されてきました。しかし、これら2つの機能は、これまで併用されていません。 ここでは、拡散する脂質と脂質二重層に囲まれた抗CD3（TCR複合体を標的とする抗体）のナノドットを作成するための新規な技術を説明します。二重層は、ラングミュア-ブロジェット/ラングミュア-シェーファー法7、15、16を用いて堆積され、必要に応じて、特定のタンパク質で官能化することができる-例えば、T細胞インテグリンのリガンド（ICAM1と呼ばれます）。また、抗CD3タンパク質ドットCOULDは、別の抗体またはCAMに置き換えること。我々はT細胞接着研究のためのプラットフォームとして、将来の使用のためのタンパク質を選択しているが、ここでは詳細な戦略は、任意のタンパク質、さらにはDNAに適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observation chamber</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer&amp;nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Water MQ&amp;nbsp;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silica beads</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gastight syringe&amp;nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film balance</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>TIRF-III system</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium Target&amp;nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&amp;egrave;me&amp;nbsp;</td><td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

現在、細胞生物学的研究のための不動態化表面の海で接着性タンパク質の島々の注文したアレイを作成するにはかなりの関心が寄せられています。過去数年間で、それは彼らに提示する分子の生化学的性質のためにも、これらの分子が提示されている方法にするだけでなく、生きている細胞が応答することがますます明らかになっています。タンパク質のマイクロパターンを作成することになりましたので、多くの生物学の研究室では標準的なものです。ナノパターンは、よりアクセス可能です。しかし、細胞間相互作用の文脈では、パターンにする必要はありませタンパク質だけでなく、脂質二重層があります。このような二重プロテオ脂質パターニングは、これまで簡単にアクセスされていません。私たちは、ガラス上でサポートタンパク質ナノドットを作成して、支持された脂質二重層（SLB）とドット間のスペースを埋め戻す方法を提案すること容易な手法を提供します。 SLBに含まトレーサー蛍光脂質の光退色から、私たちは二重層がで-PLかなり呈することを示していますANE流動性。蛍光基とタンパク質のドットを官能基化すると、イメージ、彼らと彼らは通常の六角格子に順序付けられていることを示すために私たちをことができます。代表的なドットサイズは約800nmであり、ここで実証間隔は2ミクロンです。これらの基板は、細胞接着、移動およびメカノセンシング研究用として有用なプラットフォームを提供するために期待されています。

蛍光画像は、ドットの間隔や大きさを測定するために分析しました。典型的な間隔があることが判明した1,900±80nmであり、典型的なドットサイズ600±100nmで（ 図1グラム ）でした。間隔は、マスクのために使用されるビーズのサイズによって設定されます。ドットサイズは、ビーズのサイズだけでなく、成膜条件によって設定されています。 SLBは、SLB撮像チャネルで見られる孔及びNAVイメージングチャネルに見られるドット間の完全な相補性と、それらに一意タンパク質ドットの周囲としない（ 図2）が堆積されます。連続写真漂白データの分析は、パターン化された二重層中の脂質は、流体のままであり、5μm²/秒（ 図3）の典型的な拡散定数を有することを示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig1.jpg" /> 図1：製造工程の概略図。 （A </strオング&gt;）一次ビーズマスク。挿入図は、2μmの直径のビーズで作られ、アルミニウムの薄い層で覆われて、マスクの走査型電子顕微鏡（SEM）画像を示しています。この画像で使用されるパラメータは、400 WのRFで解任nmの公称アルミニウムの厚さ200、9×10 -7の初期圧力トール、アルゴンを5 kVの加速電圧で撮像を10sccm、工程圧力6.2トルを、フラックス。画像は、ビーズ、ガラススライド上に単層中心六方格子状に配置されたアルミニウム蒸着の前に光学顕微鏡（含まれていない画像）で作られた観察を確認します。 （B）プライマリビーズマスクを除去した後のスパッタ堆積によって作成されたアルミニウムの二マスク。 （C）二マスクしかしオルガノシランの堆積およびBSA-ビオチン。アルミニウムの（d）の除去は、BSA-ビオチンのナノドットを明らかにする。 SLBの（e）の堆積。 BSA-ビオチンへのNaV結合（F）。 （G）結合<html> NaVに抗CD3。挿入図は、ナノドットアレイのエピ蛍光画像を示します。ここではNAVが蛍光標識されています。代表的なドットサイズは600±100nmであり、典型的な間隔は、1,900±80 nmです。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55060/55060fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig2.jpg" /> 図2：ナノドットとSLBパターンの相補。 （B）蛍光のNAVナノドットの蛍光トレーサー脂質とSLBのエピ蛍光画像。 （C）SLB（緑色）の海でのNAVドット（赤色）の合成画像のNaVとSLBの完全な相補性を示します。挿入図中の高速フーリエ変換（FFT）画像は、長距離秩序を示します。スケールバー：4μmで。rge.jpg」ターゲット= 『_空白』&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55060/55060fig3.jpg" /> 図3：SLB中の脂質拡散の定量化。漂白前SLBの（a）はエピ蛍光画像。タンパク質ドットは、脂質の明るい海のような暗い穴を示します。フィールド絞りは照明領域を制限します。 50秒間連続漂白後SLBの（b）は、エピ蛍光。フィールドダイアフラムによって区切られた領域内の可視ハロ脂質が移動していることを示しています。スケールバー：10μmです。 （c）フィールドダイアフラム（上）および座礁処理（下）経時強度の減衰の縁に沿って平均強度プロファイル。このデータは、典型的には5μm²/ sである拡散定数を抽出するために分析されます。

Watch this Scientific Journal Video about Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer at JoVE.com

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K ビュー.  CNRS, UMR 7325, CINaM. 私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。 

ビデオ: Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

生化学

Facile Preparation of Internally Self-assembled Lipid Particles Stabilized by Carbon Nanotubes

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled (functionalized) CNTs are used as stabilizers to produce Pickering type oil-in-water (O/W) emulsions. Lipids namely, Dimodan U and Phytantriol are used as emulsifiers, which in excess water self-assemble into the bicontinuous cubic Pn3m phase. This highly viscous phase is fragmented into smaller particles using a probe ultrasonicator in presence of conventional surfactant stabilizers or CNTs as done here. Initially, the CNTs (powder form) are dispersed in water followed by further ultrasonication with the molten lipid to form the final emulsion. During this process the CNTs get coated with lipid molecules, which in turn are presumed to surround the lipid droplets to form a particulate emulsion that is stable for months. The average size of CNT-stabilized nanostructured lipid particles is in the submicron range, which compares well with the particles stabilized using conventional surfactants. Small angle X-ray scattering data confirms the retention of the original Pn3m cubic phase in the CNT-stabilized lipid dispersions as compared to the pure lipid phase (bulk state). Blue shift and lowering of the intensities in characteristic G and G&#39; bands of CNTs observed in Raman spectroscopy characterize the interaction between CNT surface and lipid molecules. These results suggest that the interactions between the CNTs and lipids are responsible for their mutual stabilization in aqueous solutions. As the concentrations of CNTs employed for stabilization are very low and lipid molecules are able to functionalize the CNTs, the toxicity of CNTs is expected to be insignificant while their biocompatibility is greatly enhanced. Hence the present approach finds a great potential in various biomedical applications, for instance, for developing hybrid nanocarrier systems for the delivery of multiple functional molecules as in combination therapy or polytherapy.

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

カーボンナノチューブにより安定化内部自己組織化脂質粒子の簡便な調製

We present a facile method to prepare nanostructured lipid particles stabilized by carbon nanotubes (CNTs). Single-walled (pristine) and multi-walled ...

化学

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

生物工学

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Self-Assembly of Hybrid Lipid Membranes Doped with Hydrophobic Organic Molecules at the Water/Air Interface

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers can be readily functionalized and have been used in various applications such as bio-sensors and bio-devices. In this study, we introduced a planar organic molecule: copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) to dope lipid membranes. The CuPc/lipid hybrid membrane forms at the water/air interface by self-assembly. In this membrane, the hydrophobic CuPc molecules are located between the hydrophobic tails of lipid molecules, forming a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. Interestingly, an air-stable hybrid lipid bilayer can be readily formed by transferring the hybrid membrane onto a Si substrate. We report a straightforward method for incorporating nanomaterials into a lipid bilayer system, which represents a new methodology for the fabrication of biosensors and biodevices.

We report a protocol for producing a hybrid lipid membrane at the water/air interface by doping the lipid bilayer with copper (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc) molecules. The resulting hybrid lipid membrane has a lipid/CuPc/lipid sandwich structure. This protocol can also be applied to the formation of other functional nanomaterials.

水/空気界面で疎水性有機分子をドープしたハイブリッド脂質膜の自己集合

Because of their unique properties, including an ultrathin thickness (3-4 nm), ultrahigh resistivity, fluidity and self-assembly ability, lipid bilayers ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It is not only passively generated by cellular activities, but also actively regulates protein interactions and is involved in many intracellular signaling. Thus, it is of great value to examine the role of membrane curvature in regulating the distribution and dynamics of proteins and lipids. Recently, many techniques have been developed to study the relationship between the curved membrane and protein in vitro. Compared to traditional techniques, the newly developed nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offers both high-throughput and better accuracy in membrane curvature generation by forming a continuous lipid bilayer on patterned arrays of nanobars with a pre-defined membrane curvature and local flat control. Both the lipid fluidity and protein sensitivity to curved membranes can be quantitatively characterized using fluorescence microscopy imaging. Here, a detailed procedure on how to form a SLB on fabricated glass surfaces containing nanobar arrays&#160;and the characterization of curvature-sensitive proteins on such SLB are introduced. In addition, protocols for nanochip reusing and image processing are covered. Beyond the nanobar-SLB, this protocol is readily applicable to all types of nanostructured glass chips for curvature sensing studies.

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Here, a nanobar-supported lipid bilayer system is developed to provide a synthetic membrane with a defined curvature that enables the characterization of proteins with curvature sensing ability in vitro.

in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

脂質膜上の光制御可逆的タンパク質パターニング

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

著者スポットライト:人工細胞システムにおける可逆的パターニングのための写真切り替え可能なタンパク質リクルートメント

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).