私たちは、携帯アプリケーションについて実りある議論を継続するためローランLimozin、ピエール・ディラードとアストリッド・ワル感謝します。また、SEM観察と彼の助けをPLANETEのクリーンルーム施設からフレデリック・ベドゥ感謝します。この作品は、部分的に助成金番号307104 FP / 2007から2013 / ERC経由の欧州研究評議会によって資金を供給されました。

1.クリーニングガラスカバー・スライドと観察室<ol><li>ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）のような不活性材料で作られたマルチスライドトレイ上のガラスカバースライドを配置。 </li><li>界面活性剤溶液中にスライドを有するトレイと観察室（適切である石英キュベットを洗浄するために推奨される任意の製品）を浸します。 </li><li> （20と30℃の間）、室温で30分間、界面活性剤溶液中で超音波浴、超音波処理を使用して。 </li><li>超純水で5回（18.2MΩ.cm、0.059μS/ cm）をすすぎます。 </li><li> （20と30℃の間）、室温で30分間、界面活性剤溶液中の超音波処理。 </li><li>超純水で10回洗浄します。 </li><li>繰り返しは二回1.5と1.6を繰り返します。 </li><li>最大1週間（20〜30°Cの間）、室温で水に保管してください。 </li></ol>タンパク質ナノドットの2製作<ol><li>ビーズの沈着<ol><li> Deposiシリカビーズ（2％v / v、70μL）の懸濁液tを15度の傾斜で保持カバースライド（24×24ミリメートル、厚さ170ミクロン）に一滴ずつ。 </li><li> 90°ごとに15秒でガラスを反転しながら、約1分間のサスペンション広がりをしてみましょう。 </li><li>液体は、周囲条件下で蒸発することを許可します。 </li><li>最大2日間周囲条件で清浄なガラスまたはPTFE室に保管してください。 </li></ol></li><li>アルミの蒸着<ol><li>シリコン（1％）ターゲット：アルミニウム（99％）から約105ミリの間隔で回転テーブル上に、マグネトロンスパッタリング装置8（RF）無線周波数内部（セクション2.1で調製）スライドを置きます。 </li><li>ターボ分子ポンプを用いて2.6×10 -4 Paまで堆積チャンバをポンプダウン。このステップでは、可能なガス状不純物の除去のために重要です。 </li><li> 0.8 PA（6.6ミリトール）の圧力で10sccmの束と純アルゴン雰囲気（5N、99.999％）を導入。 <br/&gt;注：着信アルゴンフラックスはマスフローコントローラによって制御され、プロセス圧力が圧力計を用いて監視されます。アルゴンガスの流れは連続的であり、バルブを開く入口と出口との間のバランスによって制御されます。 </li><li> RF電力発生器のスイッチをオンにします。 注記：ここでは、13.56MHzの周波数で400〜600 Wの高周波電力の典型的な範囲を使用しました。 RF発生器は、容量性プラズマ結合モードにおける整合ネットワークと共に使用されます。反射電力を監視し、ネットワークの適応を使用して最小化されます。 </li><li>プラズマが安定した後、シャッターを保持する2分間スパッタリングターゲットの表面から可能な不純物を除去するために閉じ。 </li><li>シャッターを開き、スパッタリングが200nmの厚さのガラススライド上にアルミニウムを堆積させるために60分間継続することを可能にします。 </li><li>堆積室からターボ分子ポンプを分離し、清浄なNでチャンバを通気するゲートバルブを閉じ、アルゴンの流れをカット部屋の圧力を得ることがitrogen。アルミニウム被覆スライドを回復します。月までの周囲条件下で、清潔で密閉されたガラスやPTFEボックス内のために保管してください。 </li></ol></li><li>有機シランの蒸着<ol><li> （20と30℃の間、50 W、50/60 Hz）で室温超音波浴中で30秒間超音波処理で超純水にステップ2.2.6で調製したアルミニウム被覆スライドを浸します。 </li><li>デポジットデシケーターの底部の（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）の0.5 mLです。 注意：APTESを容易に蒸発し、有毒であるオルガノシランです。 APTESは、フローフードの下と手袋で処理する必要があります。 </li><li>デシケータ内部セラミックグリッド及び場所に（2.3.1で調製）ガラススライドを置きます。 </li><li>膜ポンプにデシケーターを接続し、低真空を生成するために30分間、最大パワーで動作。 </li><li>デシケーターのバルブを閉じ、ポンプのスイッチを切ります。 </li><li>デシケーターを熱し1時間約50℃です。 </li><li>デシケーターを開き、スライドを集めます。 </li><li>室温（20℃〜30℃）で最大48時間保存のために別の清浄なデシケーターに移します。 </li></ol></li><li>タンパク質の第一の層の堆積 - ビオチンで標識したウシ血清アルブミン（BSAビオチン） <ol><li> PTFE支持体上のセクション2.3で調製されたスライドの1を置きます。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解を25μg/ mLのBSAビオチンの預金1 mLです。室温（20〜30℃）で30分間放置します。 </li><li> PBSで10回洗浄します。光源から離れて4℃で最大24時間、サンプルを保存します。 </li></ol></li><li>アルミニウムマスクの除去<ol><li> （20と30℃の間）を、室温でオーバーナイト（pH≈12を得るために、約100 mLのPBSに1 M NaOHを滴下することにより調製）PBS中のNaOHの溶液でスライドをインキュベートします。 注意。 NaOHが腐食性であり、手袋を使用して処理されなければなりません。 </li><li>リンス超純水で10倍。 </li></ol></li></ol>サポートされている脂質二重層の3堆積（SLB） <ol><li>ラングミュアトラフのクリーニング<ol><li>ポンプを使用してラングミュアトラフのPTFEの筐体に水を除去します。 </li><li>クロロホルムに浸したリントフリー不織布使い捨てタオルできれいにします。 注意。クロロホルムは有毒であり、マスク（またはフローフード下）で、適切な手袋で、よく換気された場所で操作しなければなりません。 </li><li>ぬるま湯超純水できれいに4回（40〜50゜C）。 </li><li>冷たい超純水で少なくとも6回を清掃してください。 </li></ol></li><li>第1の脂質層の堆積<ol><li>ラングミュアトラフのPTFEの筐体にPTFEトレイを置き、その後、超純水でそれを埋めます。 </li><li> 0 MN / mで測定された圧力を設定するためにラングミュア装置の制御ソフトウェアを使用します。 </li><li> （1mg / mlの脂質溶液30μLを堆積するために1を気密ガラス/金属シリンジを使用クロロホルム中、2- dioleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DOPC））水の表面に。クロロホルムを蒸発し、脂質分子が自発的に単層を形成します。 </li><li>到達する（DOPC 27のMN / m）の所望の圧力までPTFEバリアを閉じることにより、脂質単層を圧縮するために制御ソフトウェアを使用。 </li><li>電動式クランプを使用して、PTFEエンクロージャにセクション2.5.2で調製したスライドガラスを浸漬する制御ソフトウェアを使用。 </li><li>空気 - 水界面に垂直なクランプで、スライドを保持します。 27のMN / mにおける一定の圧力を維持しながら、インタフェースを介してゆっくり（15ミリメートル/分）を上昇させる制御ソフトウェアを使用。 </li><li>即時使用のいずれかまたは（20と30℃の間）を室温で24時間までの貯蔵のために乾燥した環境内の場所。 </li></ol></li><li>第2の脂質層の堆積<ol><li> 27のMN / Mの所望の値にラングミュアトラフにおける面圧を維持します。使用して圧縮制御ラングミュア装置のソフトウェア及び/又は所望の圧力を達成するために、脂質を少量加えます。 </li><li>水平に水の表面上に、セクション3.2.6で調製した脂質単層を担持するスライドガラスを置き。各スライドは、PTFEトレイの上に浮いていることを確認してください。 </li><li>ダウンガラススライドを押し、それらが水に浸漬されるように、PTFE又は金属ピンセットを用いて、その対応するPTFEトレイに一度にスライド。押しながらスライドを傾けないでください。 </li><li>超純水は、スライドが空気にさらされていないことを確認することで満たさ晶析にスライドを含むPTFEトレーを転送するためにPTFEや金属ピンセットを使用してください。 </li><li>観察室に、二重層コーティングされたガラススライドを水中作業中に、転送するためにPTFE又は金属ピンセットを使用します。 注：観測室が晶析装置内の水の下に配置されます。観察室は、カスタムメイド、ゴムガスケットANとPTFEリングから構成されていますその底面以前に脂質二重層でコーティングされたスライドガラスから作られて水密容器を製造するために水中で組み立てることができるD鋼ケーシング、。 </li><li>水の下で動作を続け、水約1mlをチャンバ内に閉じ込められていることを保証しながら、チャンバを閉じます。 </li><li>水の中から組み立て室を取ります。それは水を通さないと、漏れがないことを確認してください。 </li><li> PBSで観察室に超純水存在1mLの10倍を添加し、500μlのPBSを除去することによって置き換えます。チャンバーは、液体の決して欠いていることを確認してください。 </li></ol></li><li> SLBブロッキング工程<ol><li>スライドセクション3.3.6で調製し（20と30℃の間）を、室温で30分間インキュベートを含む観察室にウシ血清アルブミン（BSA）の100μg/ mLのを導入します。 </li><li>除去し、PBS 10倍の500μLを添加することによって二重層をすすぎます。二重層は、4℃で24時間維持することができます。 </li></ol></li></ol>リガンド4.機能化<ol><li> 20と30°の間（室温で30分間セクション3.4.2で調製したスライドを含むチャンバ内を2μg/ mLの蛍光性または非蛍光ニュートラビジン（NAV、pH7で充電されていないアビジンの脱グリコシル化されたバージョン）を追加C）。 </li><li> 10回添加し、500μlのPBSを除去することによってリンス。 </li><li>セクション3.4.2で調製したスライドを含むチャンバーに2μgの/ mLのビオチン化抗CD3を加えます。 SLBドットの二重官能化のため、（ここで、二重層はニトリロ三酢酸（NTA）脂質+ 1％DOPCで作られている）を5μg/ mLでのFc-ICAM1 Hisタグを追加します。 （20と30℃の間）を室温で30分間放置。 </li><li> 10回添加し、500μlのPBSを除去することにより、リンス</li><li> 10回の細胞培地の500μLを添加して除去することによって、細胞培地（PBS + 0.1％BSA）を含むPBSを置き換えます。 </li><li> chambeに細胞培地の200μLを残しますスライドでrを。 </li><li>細胞を添加する前に37°Cで10分間チャンバを置きます。 </li></ol>前記細胞堆積（詳細は文献7を参照されたいです） <ol><li>注意深くチャンバー内に細胞懸濁液400μLを堆積させます。 37℃で30分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 37°Cで15分間パラホルムアルデヒドの2％（PFA）で細胞を固定します。繰り返し除去し、PBSの500μLを添加することによってPBSでPFAを交換してください。 </li></ol> 6.観察<ol><li>プロテオ脂質ナノパターンとSLB流動<ol><li> 例えば、ここで適切な照明波長（639 nm）をフィルタキューブ（EX TBP 483 + 564 + 642を用いて画像を落射蛍光モードでのタンパク質パターンを蛍光顕微鏡を使用して、BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 688）。 注：信号の強度は、ドットの内側と外側のタンパク質の量を推定するために定量化することができます。適切な照明波長（330 nm）を使用してF画像ILTERキューブ暗い穴を有する明るく見える二重層（BP 12分の365、FT 395、LP 397）。 </li><li>二重層におけるトレーサー脂質の拡散定数を測定するために、連続的な光退色（CPB）技術13、15を使用します。この観察は、好ましくは、ちょうどSLBの堆積後に行われています。 注：拡散定数を定量化するために、2つのパラメータは、CPBプロセス中に測定される：染料（緊張状態）と漂白領域（TAUD）の周囲に形成されたハローの蛍光プロファイルの減衰長の特定の漂白時間。第一は、CPBプロセス中に照明視野の中心での蛍光強度の時間変化をプロットしたものです。第二は、（定常状態に達した後12行と5枚の画像にわたって平均）照射ゾーンのエッジに強度プロファイルをプロットしたものです。曲線は、タウトとTAUDを取得するために取り付けられています。拡散定数は、TAによって与えられます。UD 2 /タウト（D = <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ）。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2002).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster.">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells.">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li><li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immunological+Synapse:+A+Molecular+Machine+Controlling+T+Cell+Activation.">The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation.</a> Science. 285, 221-228 (1999).</li><li>Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-mediated+friction+determines+morphodynamics+of+spreading+T+cells.">Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells.</a> Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+viral+antigen+processing+generates+peptide-specific+MHC+class+I+cell-surface+clusters.">Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).</li><li>Pi, F., Dillard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-Tunable+Organic+Nanodot+Arrays:+A+Versatile+Platform+for+Manipulating+and+Imaging+Cells.">Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells.</a> Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).</li><li>Deeg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation+is+determined+by+the+number+of+presented+antigens.">T cell activation is determined by the number of presented antigens.</a> Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).</li><li>Delcassian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+ligand+spacing+influences+receptor+triggering+in+T+cells+and+NK+cells.">Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells.</a> Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).</li><li>Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays.">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li><li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization.">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li><li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies.">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li><li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+and+intermembrane+distance:+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion.">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li><li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+tissue+surfaces+by+supported+membrane+coupled+ultra-thin+layer+of+hyaluronic+acid.">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li><li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography.">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li><li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+ordered+topographical+and+chemical+nano-features+from+anodic+alumina+templates.">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li><li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion.">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li><li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing.">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands.">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level.">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li><li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse.">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li><li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters.">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li><li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation.">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398 (2012).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation.">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

上述のプロトコル内の重要なステップは、サポートされている脂質二重層によってタンパク質ナノドットまたはドットの周囲の空間の背面充填の形成に関連しています。タンパク質ナノドットに対する第1の重要なステップは、ビーズ、マスクの製造です。カバースライドの洗浄が重要です。スライドはいずれか、または酸素プラズマで石英キュベットを洗浄するために推奨される洗剤液で洗...

<html>細胞接着は、細胞外マトリックス上で、または別の細胞上のそれらの対応物に結合することができる細胞膜上に存在する特殊な細胞接着分子（CAM）、タンパク質を介して行われます。接着した細胞に、ユビキタスインテグリンおよびカドヘリンを含むほとんどの接着分子は、クラスター1の形態で見出されます。多くの場合、免疫学的シナプスと呼ばれる - 抗原提示細胞（APC）とTリンパ球（T細胞）の相互作用は、二つのセルの間の界面に形成された受容体クラスターの重要性の特に顕著な図を提供します。プラットフォーム2をシグナルとして働くT細胞形態ミクロンスケールクラスターの表面上のAPC、T細胞受容体（TCR）との最初のコンタクトを形成する際に、3、4、および最終的には大きな中央超分子クラスターを形成するために集中している（CSMAC ）LASS = &quot;外部参照&quot;&gt; 5、6、7。最近、APC側に、TCRのリガンドはまた、8クラスタ化されることが示されました。 T細胞-APC相互作用の文脈では、APCは、関連するタンパク質で官能人工表面によって模倣されたハイブリッドシステムの展開は、非常にシナプスインタフェース2、3、4、5、6、7の我々の理解が進んでいます。この文脈では、標的細胞の1つのまたは複数の態様を捕捉APC模倣表面を設計することが非常に適切です。リガンドが支持された脂質二重層上にグラフトされた場合、彼らは、二重層の面内に拡散するAPC表面上の状況を模倣すると同時に、の形成を可能にすることができますCSMAC 6、7。同様に、APC上のクラスターはポリマー9、10、11、12、13、14の海でのリガンドのアイランドを作成することによって模倣されてきました。しかし、これら2つの機能は、これまで併用されていません。 ここでは、拡散する脂質と脂質二重層に囲まれた抗CD3（TCR複合体を標的とする抗体）のナノドットを作成するための新規な技術を説明します。二重層は、ラングミュア-ブロジェット/ラングミュア-シェーファー法7、15、16を用いて堆積され、必要に応じて、特定のタンパク質で官能化することができる-例えば、T細胞インテグリンのリガンド（ICAM1と呼ばれます）。また、抗CD3タンパク質ドットCOULDは、別の抗体またはCAMに置き換えること。我々はT細胞接着研究のためのプラットフォームとして、将来の使用のためのタンパク質を選択しているが、ここでは詳細な戦略は、任意のタンパク質、さらにはDNAに適合させることができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Assistent, Karl Hecht KG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Observation chamber</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex)</td>
			<td>Hella Analytics</td>
			<td>9-307-011-4-507</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-sonicator</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Labbox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallizer&#160;</td>
			<td>Shott</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidine</td>
			<td>Thermo Fischer Scientifique</td>
			<td>84607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3813</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water MQ&#160;</td>
			<td>ELGA, Veolia France</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Corpuscular Inc</td>
			<td>147114-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A3648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Biotin</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A8549</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dansyl-PE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810330C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>650471</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastight syringe&#160;</td>
			<td>Dominique Dustcher , France</td>
			<td>74453</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film balance</td>
			<td>NIMA</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td>TIRF-III system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Target&#160;</td>
			<td>Kurt J. Lesker Compagny, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radio Frequency Magnetron sputtering Syst&#232;me&#160;</td>
			<td>modified SMC 600 tool by ALCATEL , France</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ligand nano-cluster arrays in a supported lipid bilayer

現在、細胞生物学的研究のための不動態化表面の海で接着性タンパク質の島々の注文したアレイを作成するにはかなりの関心が寄せられています。過去数年間で、それは彼らに提示する分子の生化学的性質のためにも、これらの分子が提示されている方法にするだけでなく、生きている細胞が応答することがますます明らかになっています。タンパク質のマイクロパターンを作成することになりましたので、多くの生物学の研究室では標準的なものです。ナノパターンは、よりアクセス可能です。しかし、細胞間相互作用の文脈では、パターンにする必要はありませタンパク質だけでなく、脂質二重層があります。このような二重プロテオ脂質パターニングは、これまで簡単にアクセスされていません。私たちは、ガラス上でサポートタンパク質ナノドットを作成して、支持された脂質二重層（SLB）とドット間のスペースを埋め戻す方法を提案すること容易な手法を提供します。 SLBに含まトレーサー蛍光脂質の光退色から、私たちは二重層がで-PLかなり呈することを示していますANE流動性。蛍光基とタンパク質のドットを官能基化すると、イメージ、彼らと彼らは通常の六角格子に順序付けられていることを示すために私たちをことができます。代表的なドットサイズは約800nmであり、ここで実証間隔は2ミクロンです。これらの基板は、細胞接着、移動およびメカノセンシング研究用として有用なプラットフォームを提供するために期待されています。

蛍光画像は、ドットの間隔や大きさを測定するために分析しました。典型的な間隔があることが判明した1,900±80nmであり、典型的なドットサイズ600±100nmで（ 図1グラム ）でした。間隔は、マスクのために使用されるビーズのサイズによって設定されます。ドットサイズは、ビーズのサイズだけでなく、成膜条件によって設定されています。 SLBは、SLB撮像?...

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Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.9K ビュー.  CNRS, UMR 7325, CINaM. 私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。 

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

生物工学

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.