Name: reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
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This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

実行されたすべてのプロトコルステップは、ミズーリ大学の動物実験委員会（ACUC）によってレビューされ、承認されました。任意の年齢で、理論的に任意の齧歯類は、実験のために使用することができるが、このプロトコルのために、15週齢の雄のC57BL / 6マウスを使用しました。これは、非生存手術であるため、安楽死は、放血および両側気胸により達成されます。 腎臓の1灌流注：例えば、心臓、肝臓や腎臓などの臓器の灌流は、データの解釈を妨げる可能性が血液を除去します。したがって、可能であれば我々は常に臓器を灌流。 <ol><li>それは不動であるまで、イソフルラン（3 ml /分）誘導チャンバー内にマウスを置きます。次に、チャンバーの外にマウスを削除解剖台に背側にそれを置き、マウスの鼻の上にイソフルランコーンを置き、レギュレータを介して、1.5ミリリットル/分の速度でイソフルランを押してください。 </li><li>つま先のピンチRESPONSをチェック動物が麻酔の外科的平面を達成しているかどうかを評価するためにピンセットで電子。生理食塩水で腹側腹部をきれいにし、はさみで腹部を切開し、マウスの左側に（手術野のうち）腹部臓器を押してください。 </li><li> 1ccのシリンジに25ゲージの針を固定と下大静脈から血液を採取し、0.5M EDTA10μlのを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに追加します。 注：血のコレクションはオプションです。プラズマは、生化学的測定のために使用することができます。白血球は、フローサイトメトリー分析のために使用することができます。 </li><li>はさみを使用して、次のステップから血液とPBSの混合物を外に出すために、右心房に小さなカットをします。 </li><li> 50 ccのシリンジを取り、氷冷PBS（20-30 CC）で満たします。次に、（鉗子の間で静かに心を保持している間）にその頂点に左心室を穿刺、注射器に21-25 Gの針を取り付け、ゆっくりかけてリン酸緩衝生理食塩水のpHが7.4（PBS）で左心室を灌流1-2分の。 注：心はすぐに灌流の最初の数ミリリットルの際に白く。これは灌流が大静脈を介して静脈還流を経由して肝臓から血液を排出していることを示すように、ブランチングのために肝臓を守ってください。また、これは右心室の穿刺を示しているように、肺は注入の間に拡大されていないことを確認してください。肺が拡大した場合、少し戻って左心室に針を撤回し、灌流を続けます。安楽死が達成されるまで、最初の切開部から採取された時間が2分未満であります</li></ol>腎臓の2.解剖<ol><li>潅流が完了すると、その添付ファイル（血管、脂肪および副腎）と消費税から右の腎臓を解剖するためにハサミやピンセットを使用しています。 </li><li>静かに切断し、鉗子で解剖することによって、腎臓をカバーするカプセルを削除します。腎臓を計量。 注：腎臓を計量することは任意です。しかし、いくつかの実験組織のグラムあたりの細胞収量を正規化するために使用され得る腎臓サイズ/重量の変化をもたらすことができます。 </li><li>腎臓を計量した後、0.5％FBSを含むRPMI-1640の1ミリリットルに置くか、染色緩衝液サイトメトリー（50mlコニカルスクリューキャップチューブ）を流れ、さらに使用するまでチューブを氷上に置きます。 注：説明を簡単にするために、我々は、フローサイトメトリー染色緩衝液中の免疫細胞の単離の残りの部分について説明します。両方の腎臓または腎臓の1 + 1/3 回目は、下流の実験（オプション）に応じて使用することができるが、また、我々は、単一の腎臓からの免疫細胞の単離を記載します。腎臓の1/3は、タンパク質/ RNA実験のために凍結することができ、および1/3は、免疫組織化学または透過型電子顕微鏡用バッファに配置することができます。 </li></ol>腎臓の3均質化<ol><li>サンプル識別情報を5-80 mLの容量の均質化バッグを標識内部のストレーナー（STR）を削除し、それを捨てます。氷冷フローサイトメトリー染色緩衝液5mlで袋を記入し、バッファに腎臓を転送します。第二のサンプルや処理を必要とするより多くのサンプルについて、この手順を繰り返します。 </li><li>半分はフローサイトメトリー染色緩衝液中に沈め腎臓を持っており、残りの半分は、単にその上に折り畳まれるように、半分に均質化バッグを折りたたみます。 </li><li>組織ホモジナイザーをオンにして、高速（設定）回転数に設定します。下端に近いパドルを、直面している腎臓と折り畳まれた均質化バッグを置きますが袋の下端がパドルの下縁の下にスライドされていないことを確認してください。 <ol><li> 2パドルがあるとして同時に第二のサンプルを処理します。 120秒のような時間を選択します。パドルを守って腎臓を均質化するために、前後に移動します。 注：なお、この停止時間は、最初の2つの処理され、一方2以上の腎臓（または他の組織）の試料を調製するために使用することができます。 </li></オール&gt; </li><li>均質化の最初のセットで完了した後、氷に荷物を転送し、その次のサンプルのセットとして組織ホモジナイザーをリロードします。視覚的に腎臓が十分に均質化しており、何の大きな塊が表示されていないことを確認してください。 注意：一般的に、高速回転で組織ホモジナイザーで2分間は、腎臓のために十分です。 </li><li>氷上で50ミリリットルコニカルチューブに100μmのセルストレーナーを配置します。次に、セルストレーナーに完全にホモジネートをピペット。 4℃で1分間、50×gで床遠心分離機を設定し、遠心分離機にサンプルをロードします。 注：遠心分離は（細胞を含む）すべてのホモジネートは、セルストレーナーを通過したことを保証します。 </li><li>遠心機からチューブを外し、氷上に戻って置きます。セルストレーナーを破棄し、ホモジネートを保ちます。均一な細胞懸濁液を作製するために細胞ペレット/上澄みピペットまでに数回上下1×RBC溶解緩衝液の等容量（〜6ml）に加えます。 VisuaLLY、すぐにサスペンションの減少に赤色のいくつかを観察します。最大RBC溶解を達成するために、5分間氷上でチューブを残します。 注：治験責任医師は、腎臓灌流および少ない細胞操作が望まれるの確信している場合、RBC溶解工程を省略することができます。我々は、RBC溶解細胞懸濁液を施していないことにより、腎細胞収量の有意な増加を観察しました。 </li><li>細胞ペレットを形成するために、5分間500×gで、4℃に設定した遠心分離機でチューブをスピン。 注：ステップ3.6と3.7の間に、コロイダルシリカ（パーコール）ベースの密度勾配遠心分離のために準備します。 <ol><li>底ポリプロピレンチューブラウンド10ミリリットルを取り、対応するサンプル番号とラベルを付け、チューブのラックに配置します。 注：以下は、4腎臓サンプルのために十分な密度勾配試薬を作成する方法について説明します。 </li><li>フローサイトメトリー染色緩衝液の7ミリリットルを取り、15ミリリットルコニカルチューブにそれをピペット。に2 Mショ糖の1ミリリットルを追加します。0.25 Mショ糖を準備します。 </li><li>次に、別の15ミリリットルコニカルチューブに密度勾配試薬およびピペットそれの7.2ミリリットルを取ります。 72％の密度勾配試薬および0.25 Mショ糖を準備するためにフローサイトメトリー染色緩衝液および2の1.25ミリリットルMショ糖の1.55ミリリットルを追加します。 </li><li>ピペット各サンプルに対して1つの丸底ポリプロピレンチューブに72％の密度勾配試薬を1ml。 </li></ol></li></ol> 4.勾配遠心<ol><li>ステップ3.7の後、チューブを取り出し、軽く1滑らかな動きで上清をデカントし、また管を逆さまに保持されている間に形成する液体の横にあるドロップをデカント。 注：このステップは、利回りの変動を作成するのに十分な密度勾配を変更することができ、過剰の液体を残して以来、重要です。チューブは直立バック設定されている場合は、〜液体の200から300μlを細胞ペレットに残っています。 </li><li>ピペットと穏やかに、しかし積極的に細胞ペレット上に0.25 Mショ糖の1ミリリットルアップピペットとブリンまでグラム均一な懸濁液への細胞。次に、再び36％の密度勾配試薬を形成するために、細胞を混合し、激しくピペット1mlに72％の密度勾配試薬（3.7.4）を細胞懸濁液を追加し。 </li><li>ポリプロピレンパスツール（転送）ピペット内に72％の密度勾配試薬の1ミリリットルを取ります。電球にさえ圧力で（先端に液柱を保持し、気泡形成を防ぐ）、静かに細胞懸濁液（36％の密度勾配試薬）の底にパスツールピペットを挿入し、形成するために、72％の密度勾配試薬をアンロード個別の重い層。 </li><li>静かにサンプルチューブを選択し、このステップの室温で遠心分離、に置きます。 500×gで20〜30分間スピン。 </li><li>一方、対応するサンプル識別子を持つ底遠心チューブラウンドポリプロピレンの別の2セットを準備します。 </li><li>ステップ4.4が完了した後、最小限に振盪しながら、優しくポリプロピレンチューブを含むサンプルを削除し、それを下に設定管ラックに。 </li><li>最初のサンプル管とそれに対応する空のチューブを拾います。ポリプロピレンパスツールピペットで、穏やかに、しかし完全に測定吸引、上部の「ジャンク層」または「ネバネバ物質」を削除し、空の丸底遠心管に入れて。 <ol><li> （赤み[赤血球]でオフホワイト表示さ​​れる場合があります）に到達する「バフィーコート」までの勾配の上部を取り外す進みます。 〜3mmの高さは「バフィーコート」から到達した場合吸引を停止します。 注：吸引に進む前に、勾配の上部からこのようなものが完全になくなっていることを確認してください。 </li></ol></li><li>新鮮なパスツールピペット、新鮮な丸底遠心管を取り、静かにバフィーコートを除去します。細胞のほとんどを回収し、適切なサンプル識別子を持つ2 番目の新しい丸底チューブに添加されていることを確認するために、軟膜下の5ミリメートル- 3を吸引し続けます。 </li><li> Oミリリットル1-2を追加します。2 番目のチューブにフローサイトメトリー染色緩衝液fおよびピペッティングにより完全に混和します。 </li><li> 4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。フローサイトメトリー染色緩衝液で2 回目の洗浄ステップはオプションです。フローサイトメトリー染色緩衝液500μlの中に再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を計測するに進みます。 </li></ol> 5.オプション（細胞標識） <ol><li>同数の細胞のための各サンプルAliqout。 10 6個の細胞あたり0.5μgの（抗CD16 / CD32のFcR）の希釈で遮断抗体を加え、15分間氷上でインキュベートします。 </li><li>前の実際の実験に、研究者がお互いにうまく動作するように決定された一次抗体（適切なフルオロフォアにコンジュゲート）の所望のカクテルを追加します。氷上で30分間インキュベートします。 PBSで細胞を洗浄。 注：この原稿のための腎臓の免疫細胞標識のデモンストレーションのために、我々はT-LYを使用しましたmphocyteおよびマクロファージ/樹状細胞パネル。 BV421、アンチのFoxp3（クローン：FJK-16）APC、抗CD127（クローン：A7R34）：Tリンパ球パネルは修正可能生存率ステインFVS510、抗CD45（30-F11クローン）から構成されていたPE / Cy7の、抗CD44（クローン：IM7）PerCPを/のCy5.5、抗CD4（クローン：RM4-5）APC-Cy7を、抗CD8（クローン：53-6.7）BV785。 BV421、アンチLy6G（クローン：1A8）FITC、抗CD11b（クローン：M1 / 70）PerCPを-のCy5.5、アンチ：マクロファージパネルは修正可能生存率ステインFVS510、抗CD45（30-F11クローン）から構成されていましたF4 / 80（クローン：BM8）APC、抗CD11cの（クローン：N418）BV785。 </li><li>修正可能生存率ステインを追加し、5分間のベンチトップに残します。修正可能生存率ステインの過剰を除去するために、フローサイトメトリー染色緩衝液で細胞を洗浄。 </li><li>固定/透過化試薬を追加し、4ºCで一晩インキュベートします。透過性の溶液中で洗浄します。 </li><li>細胞内染色のために、10分間抗CD16 / 32のFcRと再びブロック。細胞内の汚れを追加し、20〜30分間インキュベートします。 PEでウォッシュ2倍rmeabilizationソリューション。 </li><li> FACS装置3,9を介して、フローサイトメトリー染色緩衝液および実行サンプル中の再懸濁。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

ここで信頼性の高い効率的な方法で腎臓から免疫細胞を得るための方法を提示しています。広く使用されているコラゲナーゼ消化工程（組織の機械的破壊）の主要な変更は約30分を保存し、実行可能な免疫細胞の多数の単離は4腎臓試料で2時間の下でかかります。また、私たちの研究の質問に応じて、我々は今だけ私たちの免疫細胞の単離のために（他の腎臓は、ウェスタンブロット、免疫組...

免疫系の活性化は、複数の腎疾患および病態生理学的プロセス6,10,11,13で発生します。活発な研究の潜在的な領域は、免疫系の活性化のための様々なトリガーを含む、種々の細胞型が関与する特定の疾患の設定におけるサイトカイン/ケモカインパターンなどの特定の薬物による上述のプロセスの全ての調節は、虚血 - 再灌流中、例示するために傷害（急性腎障害のモデル）、（6週間後）の修復または線維症の期間を通じて維持される数時間内の免疫細胞または骨髄由来造血細胞またはCD45 +細胞の増加がある5、 12。これらの免疫細胞は修復5,12のプロセスを調整するために、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインおよびケモカインの両方を分泌します。現在、単一細胞懸濁液中の細胞集団を標識するために同時に複数のフルオロフォアを使用する能力は、広告と増加しています4 5へのレーザーで近代的なフローサイトメトリー機のベント。これは、実質的にそれらの機能の状態3,7に基づいて細胞集団を区別するために能力を追加しました。例えば、正確に低 F4 / 80 ローのCD11b 高 Ly6b 高 CD206としてマクロファージを標識するために、少なくとも3以上のフルオロフォアは、同じ生細胞のためのゲートにサンプルボリューム、CD45 +（白血球）とLy6G-（好中球）に必要とされるであろうとこれは非常に可能な新しいフローサイトメータ3です。しかし、サイトカイン分泌、細胞増殖、細胞毒性、マクロファージの活性化およびリンパ球と単球の種々のサブセットの数の定量化のための下流のアッセイは、だけでなく、良い品質（生細胞、シングレット）が、細胞の十分な数が必要です。 腎臓における免疫系は、適応および先天性成分および複数の細胞型1,7,13両方から構成されています。例えば、マウスで2子供（1.4×10 6細胞）およびこれらの約5から15までパーセント（1,400-4,200）単離された全腎、免疫細胞のneysが一緒に百分の2から17を含むことが報告されている（28,000-266,000）CD45 +細胞は、CD4 +細胞の1です、5,12。これらのCD4 +細胞の小さな割合（百分の5から15まで、70から630までは）のFoxP3 +細胞（ 図1）1です。細胞の割合におけるこれらの段階的減少、関心の時には細胞集団（この場合、CD45 + CD4 + FoxP3の+細胞）への単なる〜100セルで表現されます。 CD45 + CD4 + FoxP3の+細胞の数が少ないことが不可欠総細胞の大多数が分離され、細胞は、サイトカイン分泌アッセイのような下流の研究のために良い品質のものであることになります。また、亜集団を定量化アッセイを実行するために十分に高い数値で表現されていないので、2-3匹のマウスから腎臓を組み合わせることが必要であり得ます。したがって、腎臓単核細胞集団の信頼性の高い効率的な分離は、スタッドのために望ましいですyの腎疾患に関連する免疫学的なスペクトル。 伝統的に、腎臓の単核細胞の単離のために、研究者らは、このようなDNアーゼ1 1,5,12を含むコラゲナーゼ1AまたはIIなどの酵素消化の様々なを使用していました。よくコラゲナーゼが最適濃度およびインキュベーション4,14,15の期間滴定を必要と、ロット番号とし、製造会社によって異なる酵素活性を有することが知られています。また、コラゲナーゼで消化が小片に腎臓を刻むための時間を追加し、反応を停止させるためのEDTA中でのインキュベーションのための加熱（37℃）バス、追加の時間で腎臓片のインキュベーションを必要とします。また、以下無菌性は、細胞培養を必要とするいくつかの下流の処置のために達成することができます。さらに重要なことは、関係する研究者と、すべての変数に応じて、それは研究室間のデータと解釈のばらつきにつながります。最近では、と機械的組織撹乱/ホモジナイザー16の開発は、コラゲナーゼ消化工程を完全に回避し、腎臓2 ​​の単純な機械的破壊によって置き換えられています。ここで、私たちは日常の免疫細胞の抽出のための腎臓の免疫細胞の単離のためのシンプルで効率的な方法を示しています。重要なことに、この技術は、肝臓および脳16のような他のソフト非線維組織に適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>Stomacher 80 Biomaster lab system</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Classic bags</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Analytical flow cytometer</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene tubes, no cap</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FVS510,&amp;nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&amp;nbsp; BV421&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m filter&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubes 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette fine tip</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flow Cytometery Staining Buffer Solution</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1x RBC Lysis Buffer</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Or equivalent equipment&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

実行することができるパネルの数は確実に腎臓から抽出することができる免疫細胞の数に依存します。ここで、我々は2パネル、Tリンパ球用とマクロファージ/樹状細胞のための1つを実行する能力を示します。 Tリンパ球のパネルでは、まず、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）のパターンを見て、 図1（左上のドットプロット）に示すように、関心の人...

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Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K ビュー.  Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital. Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

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Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

腎臓からの二重否定αβT細胞の分離

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

免疫・感染学

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

上皮細胞の再増殖および腎組織の開発のための齧歯類細胞外マトリックスの足場の調製

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

生物工学

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and transplantation. Perivascular Stromal Cells (PSCs) share characteristics with bone marrow MSCs (bmMSCs). However, they also possess, most likely due to local imprinting, tissue-specific properties and play a role in local tissue homeostasis. This tissue specificity may result in tissue specific repair, also within the human kidney. We previously showed that human kidney PSCs (kPSCs) have enhanced kidney epithelial wound healing whereas bmMSCs did not have this potential. Moreover, kPSCs can ameliorate kidney injury in vivo. Therefore, kPSCs constitute an interesting source for cell therapy, particularly for kidney diseases and renal transplantation. Here we show the detailed isolation and culture method for kPSCs from transplant-grade human kidneys based on whole-organ perfusion of digestive enzymes via the renal artery and enrichment for the perivascular marker NG2. In this way, large cell quantities can be obtained that are suitable for cellular therapy.

Here we present a novel clinical grade isolation and culture method for kidney Perivascular Stromal Cells (kPSCs) based on whole organ perfusion with digestive enzymes and NG2-cell enrichment. With this method, it is possible to acquire sufficient cell numbers for cellular therapy.

ひと腎臓血管周囲間質細胞の新規臨床等級分離法

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

医学

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal failure. In recent years, the involvement of microRNAs (miRNAs) has been reported in the pathogenesis of IgA nephropathy. However, there is no established method for profiling miRNAs in IgA nephropathy using small animal models. Therefore, we developed a reliable method for analyzing miRNA in the kidney of an IgA mouse model (HIGA mouse). The goal of this protocol is to detect the altered expression levels of miRNAs in the kidneys of HIGA mice when compared with the levels in kidneys of control mice. In brief, this method consists of four steps: 1) obtaining kidney samples from HIGA mice; 2) purifying total RNA from kidney samples; 3) synthesizing complementary DNA from total RNA; and 4) quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) of miRNAs. Using this method, we successfully detected the expression levels of several miRNAs (miR-155-5p, miR-146a-5p, and miR-21-5p) in the kidneys of HIGA mice. This new method can be applied to other studies profiling miRNAs in IgA nephropathy.

microRNAs are involved in the pathogenesis of IgA nephropathy. We have developed a reliable method for detecting microRNA expression levels in the kidneys of an IgA nephropathy mouse model (HIGA mice). This new method will facilitate to check for miRNAs involvement in IgA nephropathy.

免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

フローサイトメトリー解析のためのマウス腎臓レジデントCD8+T 細胞の分離

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

ラット腎臓からそのまま糸球体を分離する効率的なふるい分け法

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Analyses of Proteinuria, Renal Infiltration of Leukocytes, and Renal Deposition of Proteins in Lupus-prone MRL/lpr Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including the kidneys. Under such circumstances, the kidney loses its ability to clean waste from the blood and regulate salt and fluid concentrations, eventually leading to renal failure. Women, particularly those of childbearing age, are diagnosed nine times more often than men. Kidney disease is the leading cause of mortality in SLE patients. The present protocol describes a quick and simple method to measure excreted protein levels in collected urine, tracking lupus progression over time. In addition, an approach to isolate kidney mononuclear cells is provided based on size and density selection to investigate renal infiltration of leukocytes. Furthermore, an immunohistochemical method has been developed to characterize protein deposition in the glomeruli and leukocyte infiltration in the tubulointerstitial space. Together, these methods can help investigate the progression of chronic inflammation associated with the kidneys of lupus-prone MRL/lpr mice.

The present protocol describes a method to track lupus progression in mice. Two additional procedures are presented to characterize lupus nephritis based on cell infiltration and protein deposition in the kidneys.

狼瘡を起こしやすいMRL/lprマウスにおけるタンパク質尿、白血球の腎浸潤、およびタンパク質の腎沈着の解析

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disorder with no known cure and is characterized by persistent inflammation in many organs, including ...

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) imaging. They have received great attention in all research areas for the potential to analyze microscopic multicellular structures that extend over macroscopic distances. Given that kidney tubules, vasculature, nerves, and glomeruli extend in many directions, which have been only partially captured by traditional two-dimensional techniques so far, tissue clearing also opened up many new areas of kidney research. The list of optical clearing methods is rapidly growing, but it remains difficult for beginners in this field to choose the best method for a given research question. Provided here is a simple method that combines antibody labeling of thick mouse kidney slices; optical clearing with cheap, non-toxic and ready-to-use chemical ethyl cinnamate; and confocal imaging. This protocol describes how to perfuse kidneys and use an antigen-retrieval step to increase antibody- binding without requiring specialized equipment. Its application is presented in imaging different multicellular structures within the kidney, and how to troubleshoot poor antibody penetration into tissue is addressed. We also discuss the potential difficulties of imaging endogenous fluorophores and acquiring very large samples and how to overcome them. This simple protocol provides an easy-to-setup and comprehensive tool to study tissue in three dimensions.

The combination of antibody labeling, optical clearing, and advanced light microscopy allows three-dimensional analysis of complete structures or organs. Described here is a simple method to combine immunolabeling of thick kidney slices, optical clearing with ethyl cinnamate, and confocal imaging that enables visualization and quantification of three-dimensional kidney structures.

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

生物学

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for isolating, purifying, and culturing glomerular MCs have been developed and optimized since the 1980s for use in biomedical research, particularly in the field of nephrology. Mice are the most frequently used experimental animal models in research on renal diseases. In this study, we developed an optimized protocol for murine MCs isolation and ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression. This optimized approach significantly reduces the study duration for researchers and enables long-term cell preservation. The necessary equipment for the procedures is easily accessible in a basic biomedical laboratory, and the procedural steps are straightforward. The acquisition of target cells requires only 2-3 weeks, a reduction of at least 1 week compared to existing methods.

This study developed an optimized protocol for the isolation of murine mesangial cells (MCs) and their ex vivo cell culture. These cells can be passaged multiple times, frozen, revived, and cultured without compromising cell growth or protein expression.

マウス糸球体メサンギウム細胞の単離と精製の最適化

Mesangial cells (MCs) are stromal cells located in the middle space of the glomerulus, with pivotal functions in glomerular homeostasis. Methods for ...