This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

実行されたすべてのプロトコルステップは、ミズーリ大学の動物実験委員会（ACUC）によってレビューされ、承認されました。任意の年齢で、理論的に任意の齧歯類は、実験のために使用することができるが、このプロトコルのために、15週齢の雄のC57BL / 6マウスを使用しました。これは、非生存手術であるため、安楽死は、放血および両側気胸により達成されます。 腎臓の1灌流注：例えば、心臓、肝臓や腎臓などの臓器の灌流は、データの解釈を妨げる可能性が血液を除去します。したがって、可能であれば我々は常に臓器を灌流。 <ol><li>それは不動であるまで、イソフルラン（3 ml /分）誘導チャンバー内にマウスを置きます。次に、チャンバーの外にマウスを削除解剖台に背側にそれを置き、マウスの鼻の上にイソフルランコーンを置き、レギュレータを介して、1.5ミリリットル/分の速度でイソフルランを押してください。 </li><li>つま先のピンチRESPONSをチェック動物が麻酔の外科的平面を達成しているかどうかを評価するためにピンセットで電子。生理食塩水で腹側腹部をきれいにし、はさみで腹部を切開し、マウスの左側に（手術野のうち）腹部臓器を押してください。 </li><li> 1ccのシリンジに25ゲージの針を固定と下大静脈から血液を採取し、0.5M EDTA10μlのを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに追加します。 注：血のコレクションはオプションです。プラズマは、生化学的測定のために使用することができます。白血球は、フローサイトメトリー分析のために使用することができます。 </li><li>はさみを使用して、次のステップから血液とPBSの混合物を外に出すために、右心房に小さなカットをします。 </li><li> 50 ccのシリンジを取り、氷冷PBS（20-30 CC）で満たします。次に、（鉗子の間で静かに心を保持している間）にその頂点に左心室を穿刺、注射器に21-25 Gの針を取り付け、ゆっくりかけてリン酸緩衝生理食塩水のpHが7.4（PBS）で左心室を灌流1-2分の。 注：心はすぐに灌流の最初の数ミリリットルの際に白く。これは灌流が大静脈を介して静脈還流を経由して肝臓から血液を排出していることを示すように、ブランチングのために肝臓を守ってください。また、これは右心室の穿刺を示しているように、肺は注入の間に拡大されていないことを確認してください。肺が拡大した場合、少し戻って左心室に針を撤回し、灌流を続けます。安楽死が達成されるまで、最初の切開部から採取された時間が2分未満であります</li></ol>腎臓の2.解剖<ol><li>潅流が完了すると、その添付ファイル（血管、脂肪および副腎）と消費税から右の腎臓を解剖するためにハサミやピンセットを使用しています。 </li><li>静かに切断し、鉗子で解剖することによって、腎臓をカバーするカプセルを削除します。腎臓を計量。 注：腎臓を計量することは任意です。しかし、いくつかの実験組織のグラムあたりの細胞収量を正規化するために使用され得る腎臓サイズ/重量の変化をもたらすことができます。 </li><li>腎臓を計量した後、0.5％FBSを含むRPMI-1640の1ミリリットルに置くか、染色緩衝液サイトメトリー（50mlコニカルスクリューキャップチューブ）を流れ、さらに使用するまでチューブを氷上に置きます。 注：説明を簡単にするために、我々は、フローサイトメトリー染色緩衝液中の免疫細胞の単離の残りの部分について説明します。両方の腎臓または腎臓の1 + 1/3 回目は、下流の実験（オプション）に応じて使用することができるが、また、我々は、単一の腎臓からの免疫細胞の単離を記載します。腎臓の1/3は、タンパク質/ RNA実験のために凍結することができ、および1/3は、免疫組織化学または透過型電子顕微鏡用バッファに配置することができます。 </li></ol>腎臓の3均質化<ol><li>サンプル識別情報を5-80 mLの容量の均質化バッグを標識内部のストレーナー（STR）を削除し、それを捨てます。氷冷フローサイトメトリー染色緩衝液5mlで袋を記入し、バッファに腎臓を転送します。第二のサンプルや処理を必要とするより多くのサンプルについて、この手順を繰り返します。 </li><li>半分はフローサイトメトリー染色緩衝液中に沈め腎臓を持っており、残りの半分は、単にその上に折り畳まれるように、半分に均質化バッグを折りたたみます。 </li><li>組織ホモジナイザーをオンにして、高速（設定）回転数に設定します。下端に近いパドルを、直面している腎臓と折り畳まれた均質化バッグを置きますが袋の下端がパドルの下縁の下にスライドされていないことを確認してください。 <ol><li> 2パドルがあるとして同時に第二のサンプルを処理します。 120秒のような時間を選択します。パドルを守って腎臓を均質化するために、前後に移動します。 注：なお、この停止時間は、最初の2つの処理され、一方2以上の腎臓（または他の組織）の試料を調製するために使用することができます。 </li></オール&gt; </li><li>均質化の最初のセットで完了した後、氷に荷物を転送し、その次のサンプルのセットとして組織ホモジナイザーをリロードします。視覚的に腎臓が十分に均質化しており、何の大きな塊が表示されていないことを確認してください。 注意：一般的に、高速回転で組織ホモジナイザーで2分間は、腎臓のために十分です。 </li><li>氷上で50ミリリットルコニカルチューブに100μmのセルストレーナーを配置します。次に、セルストレーナーに完全にホモジネートをピペット。 4℃で1分間、50×gで床遠心分離機を設定し、遠心分離機にサンプルをロードします。 注：遠心分離は（細胞を含む）すべてのホモジネートは、セルストレーナーを通過したことを保証します。 </li><li>遠心機からチューブを外し、氷上に戻って置きます。セルストレーナーを破棄し、ホモジネートを保ちます。均一な細胞懸濁液を作製するために細胞ペレット/上澄みピペットまでに数回上下1×RBC溶解緩衝液の等容量（〜6ml）に加えます。 VisuaLLY、すぐにサスペンションの減少に赤色のいくつかを観察します。最大RBC溶解を達成するために、5分間氷上でチューブを残します。 注：治験責任医師は、腎臓灌流および少ない細胞操作が望まれるの確信している場合、RBC溶解工程を省略することができます。我々は、RBC溶解細胞懸濁液を施していないことにより、腎細胞収量の有意な増加を観察しました。 </li><li>細胞ペレットを形成するために、5分間500×gで、4℃に設定した遠心分離機でチューブをスピン。 注：ステップ3.6と3.7の間に、コロイダルシリカ（パーコール）ベースの密度勾配遠心分離のために準備します。 <ol><li>底ポリプロピレンチューブラウンド10ミリリットルを取り、対応するサンプル番号とラベルを付け、チューブのラックに配置します。 注：以下は、4腎臓サンプルのために十分な密度勾配試薬を作成する方法について説明します。 </li><li>フローサイトメトリー染色緩衝液の7ミリリットルを取り、15ミリリットルコニカルチューブにそれをピペット。に2 Mショ糖の1ミリリットルを追加します。0.25 Mショ糖を準備します。 </li><li>次に、別の15ミリリットルコニカルチューブに密度勾配試薬およびピペットそれの7.2ミリリットルを取ります。 72％の密度勾配試薬および0.25 Mショ糖を準備するためにフローサイトメトリー染色緩衝液および2の1.25ミリリットルMショ糖の1.55ミリリットルを追加します。 </li><li>ピペット各サンプルに対して1つの丸底ポリプロピレンチューブに72％の密度勾配試薬を1ml。 </li></ol></li></ol> 4.勾配遠心<ol><li>ステップ3.7の後、チューブを取り出し、軽く1滑らかな動きで上清をデカントし、また管を逆さまに保持されている間に形成する液体の横にあるドロップをデカント。 注：このステップは、利回りの変動を作成するのに十分な密度勾配を変更することができ、過剰の液体を残して以来、重要です。チューブは直立バック設定されている場合は、〜液体の200から300μlを細胞ペレットに残っています。 </li><li>ピペットと穏やかに、しかし積極的に細胞ペレット上に0.25 Mショ糖の1ミリリットルアップピペットとブリンまでグラム均一な懸濁液への細胞。次に、再び36％の密度勾配試薬を形成するために、細胞を混合し、激しくピペット1mlに72％の密度勾配試薬（3.7.4）を細胞懸濁液を追加し。 </li><li>ポリプロピレンパスツール（転送）ピペット内に72％の密度勾配試薬の1ミリリットルを取ります。電球にさえ圧力で（先端に液柱を保持し、気泡形成を防ぐ）、静かに細胞懸濁液（36％の密度勾配試薬）の底にパスツールピペットを挿入し、形成するために、72％の密度勾配試薬をアンロード個別の重い層。 </li><li>静かにサンプルチューブを選択し、このステップの室温で遠心分離、に置きます。 500×gで20〜30分間スピン。 </li><li>一方、対応するサンプル識別子を持つ底遠心チューブラウンドポリプロピレンの別の2セットを準備します。 </li><li>ステップ4.4が完了した後、最小限に振盪しながら、優しくポリプロピレンチューブを含むサンプルを削除し、それを下に設定管ラックに。 </li><li>最初のサンプル管とそれに対応する空のチューブを拾います。ポリプロピレンパスツールピペットで、穏やかに、しかし完全に測定吸引、上部の「ジャンク層」または「ネバネバ物質」を削除し、空の丸底遠心管に入れて。 <ol><li> （赤み[赤血球]でオフホワイト表示さ​​れる場合があります）に到達する「バフィーコート」までの勾配の上部を取り外す進みます。 〜3mmの高さは「バフィーコート」から到達した場合吸引を停止します。 注：吸引に進む前に、勾配の上部からこのようなものが完全になくなっていることを確認してください。 </li></ol></li><li>新鮮なパスツールピペット、新鮮な丸底遠心管を取り、静かにバフィーコートを除去します。細胞のほとんどを回収し、適切なサンプル識別子を持つ2 番目の新しい丸底チューブに添加されていることを確認するために、軟膜下の5ミリメートル- 3を吸引し続けます。 </li><li> Oミリリットル1-2を追加します。2 番目のチューブにフローサイトメトリー染色緩衝液fおよびピペッティングにより完全に混和します。 </li><li> 4℃で5分間、500×gで細胞をスピンダウン。フローサイトメトリー染色緩衝液で2 回目の洗浄ステップはオプションです。フローサイトメトリー染色緩衝液500μlの中に再懸濁し、血球計数器を用いて細胞数を計測するに進みます。 </li></ol> 5.オプション（細胞標識） <ol><li>同数の細胞のための各サンプルAliqout。 10 6個の細胞あたり0.5μgの（抗CD16 / CD32のFcR）の希釈で遮断抗体を加え、15分間氷上でインキュベートします。 </li><li>前の実際の実験に、研究者がお互いにうまく動作するように決定された一次抗体（適切なフルオロフォアにコンジュゲート）の所望のカクテルを追加します。氷上で30分間インキュベートします。 PBSで細胞を洗浄。 注：この原稿のための腎臓の免疫細胞標識のデモンストレーションのために、我々はT-LYを使用しましたmphocyteおよびマクロファージ/樹状細胞パネル。 BV421、アンチのFoxp3（クローン：FJK-16）APC、抗CD127（クローン：A7R34）：Tリンパ球パネルは修正可能生存率ステインFVS510、抗CD45（30-F11クローン）から構成されていたPE / Cy7の、抗CD44（クローン：IM7）PerCPを/のCy5.5、抗CD4（クローン：RM4-5）APC-Cy7を、抗CD8（クローン：53-6.7）BV785。 BV421、アンチLy6G（クローン：1A8）FITC、抗CD11b（クローン：M1 / 70）PerCPを-のCy5.5、アンチ：マクロファージパネルは修正可能生存率ステインFVS510、抗CD45（30-F11クローン）から構成されていましたF4 / 80（クローン：BM8）APC、抗CD11cの（クローン：N418）BV785。 </li><li>修正可能生存率ステインを追加し、5分間のベンチトップに残します。修正可能生存率ステインの過剰を除去するために、フローサイトメトリー染色緩衝液で細胞を洗浄。 </li><li>固定/透過化試薬を追加し、4ºCで一晩インキュベートします。透過性の溶液中で洗浄します。 </li><li>細胞内染色のために、10分間抗CD16 / 32のFcRと再びブロック。細胞内の汚れを追加し、20〜30分間インキュベートします。 PEでウォッシュ2倍rmeabilizationソリューション。 </li><li> FACS装置3,9を介して、フローサイトメトリー染色緩衝液および実行サンプル中の再懸濁。 </li></ol>

<ol>
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Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで信頼性の高い効率的な方法で腎臓から免疫細胞を得るための方法を提示しています。広く使用されているコラゲナーゼ消化工程（組織の機械的破壊）の主要な変更は約30分を保存し、実行可能な免疫細胞の多数の単離は4腎臓試料で2時間の下でかかります。また、私たちの研究の質問に応じて、我々は今だけ私たちの免疫細胞の単離のために（他の腎臓は、ウェスタンブロット、免疫組...

免疫系の活性化は、複数の腎疾患および病態生理学的プロセス6,10,11,13で発生します。活発な研究の潜在的な領域は、免疫系の活性化のための様々なトリガーを含む、種々の細胞型が関与する特定の疾患の設定におけるサイトカイン/ケモカインパターンなどの特定の薬物による上述のプロセスの全ての調節は、虚血 - 再灌流中、例示するために傷害（急性腎障害のモデル）、（6週間後）の修復または線維症の期間を通じて維持される数時間内の免疫細胞または骨髄由来造血細胞またはCD45 +細胞の増加がある5、 12。これらの免疫細胞は修復5,12のプロセスを調整するために、炎症誘発性および抗炎症性サイトカインおよびケモカインの両方を分泌します。現在、単一細胞懸濁液中の細胞集団を標識するために同時に複数のフルオロフォアを使用する能力は、広告と増加しています4 5へのレーザーで近代的なフローサイトメトリー機のベント。これは、実質的にそれらの機能の状態3,7に基づいて細胞集団を区別するために能力を追加しました。例えば、正確に低 F4 / 80 ローのCD11b 高 Ly6b 高 CD206としてマクロファージを標識するために、少なくとも3以上のフルオロフォアは、同じ生細胞のためのゲートにサンプルボリューム、CD45 +（白血球）とLy6G-（好中球）に必要とされるであろうとこれは非常に可能な新しいフローサイトメータ3です。しかし、サイトカイン分泌、細胞増殖、細胞毒性、マクロファージの活性化およびリンパ球と単球の種々のサブセットの数の定量化のための下流のアッセイは、だけでなく、良い品質（生細胞、シングレット）が、細胞の十分な数が必要です。 腎臓における免疫系は、適応および先天性成分および複数の細胞型1,7,13両方から構成されています。例えば、マウスで2子供（1.4×10 6細胞）およびこれらの約5から15までパーセント（1,400-4,200）単離された全腎、免疫細胞のneysが一緒に百分の2から17を含むことが報告されている（28,000-266,000）CD45 +細胞は、CD4 +細胞の1です、5,12。これらのCD4 +細胞の小さな割合（百分の5から15まで、70から630までは）のFoxP3 +細胞（ 図1）1です。細胞の割合におけるこれらの段階的減少、関心の時には細胞集団（この場合、CD45 + CD4 + FoxP3の+細胞）への単なる〜100セルで表現されます。 CD45 + CD4 + FoxP3の+細胞の数が少ないことが不可欠総細胞の大多数が分離され、細胞は、サイトカイン分泌アッセイのような下流の研究のために良い品質のものであることになります。また、亜集団を定量化アッセイを実行するために十分に高い数値で表現されていないので、2-3匹のマウスから腎臓を組み合わせることが必要であり得ます。したがって、腎臓単核細胞集団の信頼性の高い効率的な分離は、スタッドのために望ましいですyの腎疾患に関連する免疫学的なスペクトル。 伝統的に、腎臓の単核細胞の単離のために、研究者らは、このようなDNアーゼ1 1,5,12を含むコラゲナーゼ1AまたはIIなどの酵素消化の様々なを使用していました。よくコラゲナーゼが最適濃度およびインキュベーション4,14,15の期間滴定を必要と、ロット番号とし、製造会社によって異なる酵素活性を有することが知られています。また、コラゲナーゼで消化が小片に腎臓を刻むための時間を追加し、反応を停止させるためのEDTA中でのインキュベーションのための加熱（37℃）バス、追加の時間で腎臓片のインキュベーションを必要とします。また、以下無菌性は、細胞培養を必要とするいくつかの下流の処置のために達成することができます。さらに重要なことは、関係する研究者と、すべての変数に応じて、それは研究室間のデータと解釈のばらつきにつながります。最近では、と機械的組織撹乱/ホモジナイザー16の開発は、コラゲナーゼ消化工程を完全に回避し、腎臓2 ​​の単純な機械的破壊によって置き換えられています。ここで、私たちは日常の免疫細胞の抽出のための腎臓の免疫細胞の単離のためのシンプルで効率的な方法を示しています。重要なことに、この技術は、肝臓および脳16のような他のソフト非線維組織に適合させることができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stomacher 80 Biomaster lab system</td>
			<td>Seward</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher 80 Classic bags</td>
			<td>Seward</td>
			<td>BA6040/STR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63514-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical flow cytometer</td>
			<td>BD LSR-X20 Fortessa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes, no cap</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixable Viability Stain</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FVS510,&#160; 564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td>
			<td>EBioscience</td>
			<td>14-0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&#160; BV421&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>103133/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td>
			<td>EBioscience</td>
			<td>17-5773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135013/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103031/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100413/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100749/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127605/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101227/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123115/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117335/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>145705/6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>137803/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Tubes 50 ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Tubes 15 ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette fine tip</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>232</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometery Staining Buffer Solution</td>
			<td>EBioscience</td>
			<td>00-4222-26</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X RBC Lysis Buffer</td>
			<td>EBioscience</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td>Or equivalent equipment&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reliable and high efficiency extraction of kidney immune cells

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

実行することができるパネルの数は確実に腎臓から抽出することができる免疫細胞の数に依存します。ここで、我々は2パネル、Tリンパ球用とマクロファージ/樹状細胞のための1つを実行する能力を示します。 Tリンパ球のパネルでは、まず、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）のパターンを見て、 図1（左上のドットプロット）に示すように、関心の人...

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Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

reliable-and-high-efficiency-extraction-of-kidney-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K ビュー.  Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital. Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

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Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

免疫・感染学

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

細胞星状に7つのステップ

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

機能心臓の免疫細胞の単離

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

脂肪組織の免疫細胞の単離

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

腎臓からの二重否定αβT細胞の分離

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with functional compartmentalization both during steady state and during different forms of inflammation. Until recently, the study of immune cells in the heart required the use of microscopy or poorly developed digestion protocols, which provided enough sensitivity during severe inflammation but were unable to confidently identify small &#8212; but key &#8212; populations of cells during steady state. Here, we discuss a simple method combining enzymatic (collagenase, hyaluronidase and DNAse) and mechanical digestion of murine hearts preceded by intravascular administration of fluorescently-labelled antibodies to differentiate small but unavoidable intravascular cell contaminants. This method generates a suspension of isolated viable cells that can be analyzed by flow cytometry for identification, phenotyping and quantification, or further purified with fluorescence-activated cell sorting or magnetic bead separation for transcriptional analysis or in vitro studies. We include an example of a step-by-step flow cytometric analysis to differentiate the key macrophage and dendritic cell populations of the heart. For a medium sized experiment (10 hearts) the completion of the procedure requires 2&#8211;3 h.

This protocol presents a simple and efficient method to isolate, identify and quantify immune cells residing in the myocardium of mice during steady state or inflammation. The protocol combines enzymatic and mechanical digestion for the generation of a single cell suspension that can be further analyzed by flow cytometry.

心の血管外免疫細胞の分離と同定

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

要約

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フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

細胞星状に7つのステップ

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

機能心臓の免疫細胞の単離

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

脂肪組織の免疫細胞の単離

腎臓からの二重否定αβT細胞の分離

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチウイルスの伝達効率を向上します。

心の血管外免疫細胞の分離と同定

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

要約

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フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

細胞星状に7つのステップ

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

機能心臓の免疫細胞の単離

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

脂肪組織の免疫細胞の単離

腎臓からの二重否定αβT細胞の分離

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

心の血管外免疫細胞の分離と同定

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチウイルスの伝達効率を向上します。