Name: high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96ウェルのロングプライマーPCR <ol><li> -80℃の冷凍庫でプレ凍結96ウェルPCRクーラー。 </li><li>プレート当たり2415マイクロリットルの総容積のために、のddH 2 O 2100μlを、105μlのPCRグレードのDMSO、105μlの10 mMのdNTPを、105μlのPPOTテンプレート（25 ngの/μl）を9：10 mlチューブでは、マスターミックスAを準備。 </li><li>アリコートを96ウェルPCRプレートの各ウェルに23μL。 </li><li> P20の12チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用してもロードされた各プライマーをプールし、100μMの2μLを加えます。あらかじめ冷却PCRクーラーにフィルム、場所板をシールし、-80℃で20分間の最低凍結することができます。 </li><li> 10ミリリットルのチューブでは、マスターミックスBを用意：2048μlののddH 2 O、525μlの10×緩衝液、プレート当たり2626マイクロリットルの総容量52.5μlのポリメラーゼ。 </li><li> -80°Cの冷凍庫からプレートおよびPCRクーラーを取り外します。 </li><li> PCRクーラー上の静止プレートと、フリーズの上に25μlのマスターミックスBを追加nはマスターミックスAを50μlの総反応容量のために。これは重要な時期であり、そしてミックスAを解凍する前に完了する必要があります。フィルムでプレートをシール。 </li><li> 94℃を10分間7分間72℃での最終伸長期間に続いて2分間30秒15秒94℃の30サイクル、65℃、72℃、その後、次のようにサーマルサイクラーを設定します。 。 </li><li>ブロックが94℃に達した後、PCRプレートをロードします。 </li></ol> 96ウェルのロングプライマーPCRの2検証<ol><li>ウェルの4行のゲルを得るために、4×28ウェルコームとトリス酢酸EDTA（TAE）ランニング緩衝液中で大きな1％（w / v）アガロースゲルをキャスト。 12チャンネルのマルチチャンネルピペットの先端に櫛の代替歯の位置を合わせます。レーンがロードされた後、慎重にTAEランニング緩衝液にゲルを浸します。 </li><li> 1 番目と28 番目のウェルの各列にロード1 kbのDNAラダー。 </li><li> P20 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを用いて、PCR産物でdirの2μLを移しますectlyゲル（ 図1A）の各レーンへ。アンプリコンを汚染する可能性を低減するために迅速にこれを行います。 <ol><li> （ - レーン3、A2 - レーン5 ...... A11 - レーン23、A12 - A1レーン25）ゲルの1行目の奇数番号のレーンにPCRプレートのA列からのPCR産物をロードし、PCR産物をロードゲルの1 行目の偶数番号のレーンにPCRプレートの列Bから（B1 -レーン4、A2 -レーン6 ...... B11 -レーン24、B12 -レーン26）。 </li><li>偶数レーンにレーン番号、行D奇数に列Cと、上記のように同じパターンを使用して、PCRプレートの列CおよびDからのPCR産物を読み込みます。 PCRプレートの各ウェルは、ゲル上にロードされるまで、この負荷パターンを続けます。 DNAローディングバッファーは、このゲルをロードする必要はありません。 </li></ol></li><li>ランニングタンクにゲルを置き、ゲルが水没するまでバッファを実行しているTAEでタンクを埋めます。 30分間100 Vで実行し、UVトランスイルミネーターを使用して視覚化します。例えばゲルについては、 図1Bを参照してください。 注：PCR産物は、数週間前、トランスフェクションのために-20℃で保存することができ</li></ol> 3. 96ウェルトランスフェクション<ol><li> T.を使用しますトリパノソーマ procyclicフォーム細胞株は、この手順のためSMOXP9 10とFCS 10 10％を含むSDM-79培地中で増殖。 </li><li>トランスフェクションあたり1×10 7細胞を使用してください（1.1×10 9細胞の合計）Nタンパク質の末端およびトランスフェクションあたり2×10 7細胞にタグ付け（2.2×10 9細胞の合計）のC末端にタグ付けタンパク質。トランスフェクションの前に数日間中間対数（1.2×10 6 -1×10 7細胞/ ml）で細胞を維持し、5-8×10 6細胞/ mlの密度で、トランスフェクションのために細胞を回収。 </li><li>トランスフェクションのための冷凍PCR産物を室温で解凍することができます。 </li><li>ヘムを用いて細胞を数えますocytometerまたは自動セルカウンター。 </li><li>ペレットを10分間、800×gで、複数の50 mlのチューブ内のセルの数を必要としました。 </li><li>遠心廃棄上清後で、cytomix（0.8mMのEGTA、24 mMのKClを修飾10ml中に0.15ミリモルのCaCl 2、10mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.6、25mMのHEPES-KOH pH7.6、2.6ミリモルのMgCl 2を 、細胞を再懸濁チューブあたり0.5％（w / v）のグルコース、100μg/ mlのBSA、1mMのヒポキサン​​チン、144 mMのスクロース）。単一の管に、すべてのセル・ソリューションを移し、10分間、800×gで再びスピン。 </li><li>遠心分離後、上清を廃棄し、5×10 7細胞/ mlの最終濃度のために修飾cytomix 23 ml中に細胞を再懸濁。 </li><li>細胞が回転している間に、4×24ウェル組織培養プレートの各ウェルにSDM-79培地1mlを加えます。プレートのADにラベルを付け、プレートの向きを助けるために永久的なマーカーで各プレート上の周りにもA1をリングを描きます。 </li><li>エレクトロポにプレートハンドラーを接続します。 electropora上器ユニットは、1500 Vへの電圧、100マイクロ秒のパルス長と12へのパルス数と、500ミリ秒のパルス間隔を設定します。プレートハンドラーでは、これは、そのエレクトロはエレクトロポレーションプレートの12列のそれぞれに単一パルスを印加するようになります1にパルス数を設定します。 </li><li> P200 12チャンネルマルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルの使い捨てエレクトロポレーションプレートを、4mMのギャップにPCRプレートからPCR反応を転送します。 </li><li>細胞は、紡糸されており、5×10 7細胞/ ml（ステップ3.7）の最終濃度に再懸濁されたときに、試薬容器に移します。ピペットP200 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを用いて、エレクトロポレーションプレートの各ウェルに細胞溶液200μlを、ピペッティングによりPCR産物と混合します。 </li><li>組織を使用することにより、短絡を回避するために、プレートの上から任意の液滴を除去します。 </li><li>エレクトロポレーションプレートの上に板パッケージに設けられたシールフィルム、POSを適用各列の上部と下部に覆われていない電極用の穴を残すようにそれをitioning。フィルムを導くために使用される隆起した点をカバーすることは避けてください。 </li><li>プレートハンドラーへのエレクトロポレーションプレートをロードし、蓋を閉じます。エレクトロユニットを押し「パルス」。 </li><li>エレクトロポレーション後、すぐに4×24ウェル組織培養プレートに96ウェルエレクトロポレーションプレートから細胞を移します。細胞を転送するには、他のすべての先端が欠けているとP200 12チャンネルのマルチチャンネルピペットを使用するように、残りの6つのヒントは、24ウェル組織培養プレート上の6行と列に並ぶこと。 24ウェル組織培養プレート（ 図2A）に予め定義されたパターンで、96ウェルエレクトロポレーションプレートでエレクトロポレーションした細胞を移します。 </li><li> P200のピペットチップを準備 - 各96ウェルのトランスフェクションのために除去他のすべての列と96のヒントの2箱を準備します。 <ol><li> 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送ウェルA1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11へプレート24ウェル組織培養プレートの列A、B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11列Bに、C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11行のCおよびD1 / D3 / D5 / D7へ行D.へ/ D9 / D11 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転送後、96ウェルプレート中のウェルは、その後で対応するウェルから培地で洗浄されています24-ウェルプレートの洗浄は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。 </li><li> 24ウェルプレートB列Aに96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送ウェルE1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11、F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11列Bに、G1 / G3 / G5 / 96でのG7 / 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転写後行D.に行のCおよびH1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11へG9 / G11、井戸型ウェルプレートを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。 </li><li> 24ウェルプレートのC列A、B2 / B4 / B6 / B 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送のウェルA2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A128 / B10 / B12列Bに、C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 C列と96から6ウェルの各セットの転写後行D.へD2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12には、 24ウェルプレートに型ウェルプレートは、96ウェルプレート中のウェルを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。 </li><li> 96ウェルエレクトロポレーションプレート上の転送井戸E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 24ウェルプレートD列AにB行に、F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12、G2 / G4 / G6 / 24ウェルプレートに、96ウェルプレートから6ウェルの各セットの転写後行D.に行のCおよびH2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12にG8 / G10 / G12、96のウェル型ウェルプレートを、次いで、24ウェルプレートの対応するウェルから培地で洗浄し、洗浄液は、その後、24ウェルプレートのウェルに戻されます。 </li></ol></li><li>倒立位相差顕微鏡を用いて、細胞を確認するために、各列のウェル1を調べます。で生細胞と死細胞の混合物があるでしょう細胞破片のかなりの量。それらは位相差顕微鏡の下で明るくなり、移動されるので、生細胞を死細胞と区別することができます。 </li><li>タイトなシールを形成する蓋付きの清潔な、プラスチック製の箱に24ウェルプレートを置きます。 28℃のインキュベーターにボックスを置きます。 </li><li>後で時間6-8との間には、各ウェルに2倍の選択抗生物質を含む10％FCSをSDM-79の1ミリリットルを追加します。我々の経験では、遺伝子はN末端にタグ付けされた細胞株は、選択薬剤の高い濃度に対して耐性です。したがって、一例としてブラストサイジン用いて、N末端にタグ付けすることを20μg/ mlのブラストサイジンの最終濃度を必要とし、C末端にタグ付けを10μg/ mlのブラストサイジンの最終濃度を必要とします。 注：トランスジェニック細胞株を9-10日、トランスフェクション後に見えるようになります。 </li><li>少なくとも2倍、新鮮な薬剤やメディアでの分析の前に通過。 図2Bは、典型的な96ウェルtransfeからの結果を示しますN末端に96の異なるタンパク質をタグ付けするためのction。それは健康、薬剤耐性細胞が含まれているかどうかを判断するために、位相差顕微鏡により各ウェルを評価します。健康だけでなく、位相契約顕微鏡で明るく、主に（&lt;95％）高活性の細胞が含まれています。落射蛍光顕微鏡法またはウェスタンブロットによるその後の分析は、タンパク質が正常にタグ付けされているかどうかを決定する必要があります。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA.">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).</li><li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome.">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li><li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance.">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li><li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+enabling+efficient,+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids.">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197 (2015).</li><li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor.">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037 (2012).</li><li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li><li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li><li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., G&#252;nzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination.">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

最後の5年から10年におけるプロテオミクスとトランスクリプトミクスの方法の感度の劇的な改善は、遺伝子およびそれらの製品の何千もの貴重なデータを提供してきました。しかし、これらのタンパク質の機能に対応するためのツールが追いついていません。 タンパク質のタグ付けは、その機能を決定するために多くの実験を容易にします。例えば、タンパク質は、局在化および共局在研究を容易にするために、異なる色の様々な蛍光タンパク質に融合することができます。このようなAPEX2やminiSOG 11,12などの電子顕微鏡用に開発されたタグ、タグタンパク質の超微局在を可能にします。このようなTAPタグ、およびProtC-TEV-PROTA（PTP）などの生化学用のタグは、7,13は、結合パートナーの同定のためまたはインビトロ生化学アッセイでタンパク質と結合した複合体の精製を可能にするタグ。 protocの成功に重要である特定の手順、PCRマスターミックス1へのDMSOの取り込みマスターミックス2、マスターミックス2の商業ポリメラーゼの使用とcytomixエレクトロポレーションバッファの変更を加える前に、PCRマスターミックス1の凍結：オールがあります。我々の経験では、陽性ウェルの類似の比率を達成するために、N末端タグのトランスフェクションのためのように、C末端タグのトランスフェクションのための細胞の二重の数を使用する必要があります。記載されているようにそのため、すべてのステップを実行する必要があります。 この技術は、昆虫procyclicフォームトリパノソーマをトランスフェクションする際に成功する唯一の可能性があります。血流フォームは低いトランスフェクション効率14を持って、しかもそれらが原因で、選択薬とは無関係の密度依存毒性に選択中に死亡する可能性があります。したがって、我々の以前のプロトコルは、血流フォームトリパノソーマ9のタグ付けのための現在の最高の技術を表しています。また、トランス、その可能性がありますフェクション効率は、特定のトリパノソーマの分離株に依存して変化するであろう。他の株は、追加の最適化を必要とするかもしれない - このプロトコルは927 SMOX procyclicフォームを使用して最適化しました。成功の確率を高めることができる対策は、次のとおり、PCRアンプリコンの量を増加させるトランスフェクションに含まれるセルの数を増加させます。 我々は、タンパク質の数百を並列にタグを付けることができます方法を提示します。これは、既存の大規模なデータセットを補完し、コミュニティに貴重な情報を提供し、局在との相互作用に大規模な研究を促進します。プライマーテンプレートは、リクエストに応じて利用可能であり、プラスミドテンプレートのリストは、から入手できます。http://www.sdeanresearch.com/

トリパノソーマは 、ウシにおける人間のアフリカtrypanosomasisとナガナ病を引き起こす寄生原虫である。T.トリパノソーマは 、高品質のゲノム、多数のプロテオミクスおよびトランスクリプトームデータセットとよく発達した分子ツール1-3の組み合わせにタンパク質機能の解析のための理想的な生物です。プロテオミクスおよびシーケンシングの進歩は、潜在的に興味深い遺伝子4-6ハイライト表示し、大規模なデータセットをもたらしています。しかし、多くの遺伝子は、既存のデータベースに、それらに関連する最小限の情報を持っています。タンパク質の機能的特徴付けを支援するためのハイスループット法が必要とされています。 タグ付けされたタンパク質の発現は、タンパク質の機能への洞察の多様性を与えることができます。例えば、蛍光タンパク質またはエピトープでタグ付けされたタンパク質は、protのについての情報を提供する、蛍光顕微鏡によってローカライズすることができますEINはその生物学的効果を発揮する可能性があります。また、TAP 7でタグ付けされたタンパク質は、HaloTag 8またはHisタグは、生化学的ア ​​ッセイおよびその相互作用パートナーの同定のために精製することができます。 我々は最近、T.ための堅牢なタグ付けの方法論を開発しましたトリパノソーマ 9。これは、トランスフェクションのためのDNAを生成するために、長いプライマーPCRを使用し、並列中のタンパク質の数十のタギング許可 - 既存のプロトコルへの主要な改善を。我々は今一桁procyclic形で、このプロトコルの拡張性を改善しています。ここでは、回復と選択が24ウェルプレート内で発生して、96ウェルプレートに我々の我々は、PCRを行う方法およびトランスフェクションを示します。タンパク質の数百人が今並列にタグを付けることができますように、この方法は、全体トリパノソーマゲノムをタグ付けするための費用対効果や実現可能な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

この代表的なトランスフェクションでは、プライマーはTagItのperlスクリプト9を使用して設計され 、商業的に合成しました。 96ウェルPCRを行うと説明した （ 図1A）のように検証されました。この例では、96分の95のPCR（ 図1B）に成功しました。我々の経験では、成功したPCRにはなりません元のプライマーまたは再合成されたプライマーを用いたいずれかの障害が発生した反応を繰り返します。 アンプリコンは、エレクトロポレーション（ 図2A）のための96ウェルエレクトロポレーションプレートに移し、次いで、回収および選択のための24ウェル培養プレートに移しました。選択が起こることを可能にするのに十分な時間の後、ウェルを、さらなる分析の前に、生存のために記録しました。この例では、96分の88ウェル（92％）は、15日間の選択後に陽性でした。 <imgのALT = &quot;図1&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; 図1：PCRの検証のために、アガロースゲルに96ウェルPCRプレートからPCR産物を転送するための長いプライマーPCR（A）パターンの検証 。 （B）N末端 ​​に95の遺伝子をタグ付けするための代表的な96ウェルPCR検証ゲル、およびトランスフェクションにおけるネガティブコントロールとして機能するように、5 &#39;標的と相同性を含まない1アンプリコン。サンプルは、1％（w / v）アガロースゲルにロードし、30分間100Vで解決されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> 図2：96ウェルエレクトロポレーションおよび選択 96ウェルエレクトロポレーションPLATのエレクトロポレーションした細胞を転送するための（A）パターン。24ウェル組織培養プレートに、E。 （B）24ウェルプレートにおける選択の15日後に典型的な生/死得点を模式的に示します。グリーンはグレーのみ死細胞とよく表して、成功したトランスフェクションを表します。この例では、ウェルの96分の88（92％）が正常にトランスフェクトされた寄生虫が含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K ビュー.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ビデオ: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

のテロメアG -オーバーハング構造の検討トリパノソーマ</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

免疫・感染学

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

遺伝学

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

の遺伝的操作<em&gt;Δku80</emの機能ゲノム解析のための&gt;株<em&gt;トキソプラズマ</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

インビトロ β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いた トリパノソーマクルジ のすべてのライフサイクル段階に対する薬物スクリーニング

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

生化学

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

の検出<em&gt;トリパノソーマ</em磁気活性化細胞選別し、フローサイトメトリーによって&gt;バリアント表面糖タンパク質の切り替え

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Trypanosoma bruceiにおけるグリコソームpHのためのpHluorin2を用いたセンサの開発

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

著者スポットライト:pHluorin2バイオセンサーを使用した Trypanosoma brucei のグリコソームpHモニタリングの進歩

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

ハイスループット遺伝子タギングで

要約

さらに動画を探す

この動画の章

のテロメアG -オーバーハング構造の検討トリパノソーマ

CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

の遺伝的操作

アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

インビトロ β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いたトリパノソーマクルジのすべてのライフサイクル段階に対する薬物スクリーニング

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

の検出

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチルセルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

ハイスループット遺伝子タギングで

要約

さらに動画を探す

この動画の章

のテロメアG -オーバーハング構造の検討トリパノソーマ

CRISPR/Cas9システムを用いたトリパノソマ・クルジのアマスティゴットステージに遺伝子ノックアウトを直接導入

の遺伝的操作

アフリカトリパノソーマにグライコダイナミクスを監視する蛍光タンパク質を使用した

インビトロ β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いた トリパノソーマクルジ のすべてのライフサイクル段階に対する薬物スクリーニング

アフリカトリパノソーマ症の後期感染を検出するための生物発光イメージング

の検出

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチル セルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

生きているTrypanosoma bruceiの動的グリコソームpH変化の測定

インビトロ β-ガラクトシダーゼを発現する寄生虫を用いたトリパノソーマクルジのすべてのライフサイクル段階に対する薬物スクリーニング

陰イオン交換器 (ジエチルアミノエチルセルロース列) による血中からのアフリカを含む細胞外の Trypanosomes の精製