この方法は、植物性チラコイド膜中の光合成タンパク質複合体の組成および動的組織に関する重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、天然タンパク質複合体間の機能的相互作用の分析を可能にし、様々な環境条件におけるタンパク質複合体組織の可塑性を解明することです。0.75ミリメートルのスペーサーを使用して、メーカーの指示に従って、ゲルキャスター8センチメートルを10センチメートルプレートで設定します。
攪拌板に勾配ミキサーを置き、チューブで蠕動ポンプと接続します。チューブの反対側に注射針を取り付け、ガラスとアルミニウム板の間に針を置きます。重い部屋に磁気スターラーを置きます。
分離ゲル勾配に使用するテキストプロトコルに詳述されているように、15ミリリットルの円錐型遠心分離管に3.5%および12.5%のアクリルアミド溶液を調製します。不時の重合を防ぐために、溶液を準備しながら、氷の上に遠心管を保ちます。ソリューションをグラデーションミキサーにピペットする直前に、5%APS と TEMED を追加します。
重い部屋に12.5%の解決をピペット。2つのチャンバを接続するバルブを開き、溶液がライトチャンバーに入るようにすることで、軽いチャンバと重いチャンバーを接続するチャネルから気泡を取り除きます。バルブを閉じ、溶液の痕跡を重いチャンバーに戻します。
最後に、3.5%溶液を光チャンバにピペットします。磁気スターラーのスイッチを入れ。バルブを開き、蠕動ポンプのスイッチを入れる。
ゲル溶液が1分間に約0.5ミリリットルの流量でガラスとアルミニウム板の間を流れるようにします。針は常に液体の上になければなりません。重く、軽い部屋が空になったときに超純水でそれらを満たす。
そして、水がゲル表面を穏やかに重ねるようにします。ゲル重合は室温で約1〜2時間かかります。室温で積層ゲル用に3%アクリルアミド溶液を調製します。
重合分離ゲルの上に積層ゲルをピペットし、ガラスとアルミニウム板の間にサンプルゲルコームを配置し、気泡を避ける。ゲルを室温で30~60分間重合させた後、超純水の下でくしを静かに取り除きます。この時点でゲルは、数日間湿った状態で正の摂氏4度で保存することができます。
氷冷25BTH20Gバッファーで分離したチラコイドを1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度に希釈する。各チラコイドサンプルに2本のチューブを用意し、β-DMとデジコニンの可溶化を行います。次に、等量の洗剤バッファーを追加します。
洗剤とチラコイドサンプルをピペットでやさしく混ぜ、気泡を作らないようにします。β-DM可溶化のために氷の上で2分間チラコイドを可溶化する。またはジジトニン可溶化のためのロッカーまたはシェーカーに連続的な穏やかな混合と室温で10分。
インキュベーションに続いて、摂氏4度で20分間18,000gで遠心分離により無溶化した材料を取り除きます。上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、サンプルにクーマシーブリリアントブルーバッファーの1/10ボリュームを追加します。垂直電気泳動システムでゲルを設定します。
上部バッファーチャンバーに青いカソード バッファーを充填し、アノード バッファーを下側バッファーチャンバに注ぎます。チラシッドのサンプルを井戸に積み込みます。電気泳動を開始し、テキストプロトコルにリストされている電圧を徐々に増やします。
冷たい部屋を使用するか、冷却システムでゲル温度を調整するか、正の4度でゲルを摂氏4度で実行します。サンプル前面がゲルの約3/3を移行したら、青いカソードバッファーをクリアカソードバッファーに変更します。電気泳動の実行後、画像のアーカイブのための写真スキャナでゲルをスキャンします。
2-SDS PAGEを行うために、1ミリメートルスペーサーを使用して垂直電気泳動システムを組み立てます。テキストプロトコルに記載されているように、2Dコームを使用して標準SDSゲルを準備します。BNゲルから車線を切り、5ミリリットルのチューブに入れる。
その後、レムリバッファーの2ミリリットルを追加し、室温で穏やかな揺れで45分間ストリップをインキュベートします。気泡を避けるゲルの上にスペーサーの助けを借りて車線を置きます。濾紙の狭い部分に分子量マーカーのピペット5マイクロリットルを、標準ウェルに置きます。
BNゲルストリップとマーカーペーパーを封止するには、ゲルストリップの上にランニングバッファに0.5%のアガロースを注ぎ、固化させます。標準的なプロトコルに従って電気泳動を行います。電気泳動の実行後、SUPROルビー染色または銀染色でタンパク質を可視化します。
β-DMおよびジジトニン可溶化サンプルのチラコイドタンパク質複合体パターンの代表的な結果をここに示す。小さな複合体は、電気泳動の実行中に速く移動し、したがって、ゲルの下部にあります。一方、大きな複合体はゲルの上部にあります。
デジコニンは一般的に大規模な集合体でタンパク質複合体を保存し、βDMは複合体間の不安定タンパク質とタンパク質の相互作用を妨げる。β-DMとジギコニン可溶化チラコイドのタンパク質複合体のサブユニット組成をここに提示する。各複合のサブ単位は、位置合わせされた複合系の下の垂直線から見つかります。
原則として、2次元ゲル内の各スポットは、個々のタンパク質を表す。しかし実際には、同じ分子量のタンパク質が1箇所に存在する可能性があります。スポットの同定は質量分析分析に基づいています。
この手順を適用した後、タンパク質複合体に構造的な洞察を得るために、青色の天然ゲルから溶出したタンパク質複合体の電子顕微鏡および単一粒子分析のような他の方法を継続することができます。未知のタンパク質サブユニットを同定するために、2次元SDS PAGEから個々のタンパク質スポットを質量スペックで分析することができる。アクリルアミドとジジトニンを使用すると非常に有害であり、保護手袋を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取られる必要があることを忘れないでください。
