本プロトコルは、経口抗生物質投与後のマウスの腸内微生物叢である変化を定量する信頼できる方法を提供する。これは、炎症性腸疾患などの微生物異生症に関連する病理の洞察を提供するクロス微生物叢相互作用の研究に役立ちます。これらの抗生物質治療体制の主な利点は、通常マウスへの経口抗生物質投与に関連する特徴的な体重減少を防ぐことである。
経口ギャバジを介して抗生物質治療をプリフォームするには、技術プロトコルに記載されているように準備されたストック溶液を混合することによって抗生物質のカクテルを準備する。50マイクロリットルのアンピシリン、50マイクロリットルのゲンタマイシン、50マイクロリットルのネオマイシン、メトロニダゾール500マイクロリットル、バンコマイシン25マイクロリットル、325マイクロリットルの水をミリリットル混合する体積の場合。任意の泡を排除しながら、1ミリリットルの注射器に抗生物質ミックスをロードし、適切なゲージガベージ針を取り付けます。
しっかりとマウスの肩の上に皮膚をつかみ、食道をまっすぐにするために頭と首を伸ばします。口の屋根に沿って咽頭の後ろに向かって、給餌針のボール先端を向けます。その後、穏やかに食道にそれを渡し、溶液の200マイクロリットルを注入します。
実験期間中、抗生物質カクテルを1日1回投与します。または、飲料水を介して抗生物質を投与するには、技術プロトコルに記載されているように抗生物質のカクテルを準備します。これはマウスの脱水を防ぐための重要な要因であるため、抗生物質混合物に甘味料を含めることが重要です。
抗生物質カクテルをボトル1本につき約100ミリリットルの水筒に充填します。ボトルを光から保護し、マウスケージに入れます。実験期間中、抗生物質カクテルを週に2回新鮮なストックに置き換えます。
マウスの体重と一般的な健康状態の注意深いモニタリングは、抗生物質投与を通じて毎日事前に形成されるべきである。サンプルコレクション用に2ミリリットルオートクレーブチューブの重量を量り、ラベルを付けます。新鮮な便サンプルの収集のために、各マウスを抑制剤に置きます。
次に、コレクションチューブ内のアヌスから直接便ペレットを収集します。技術プロトコルに記載されているように安楽死を行った後、腹部を完全に露出させたマウスの死体を置き、70%エタノールで腹部領域をスプレーします。殺菌された鉗子およびはさみを使用して、腹部の横断切開を行い、内部組織を損傷することなく腹膜を露出させる。
腹膜を持ち上げ、切開して腸を露出させる。鉗子とはさみで腸を取り除き、滅菌ペトリ皿に入れます。慎重に腸間膜動脈や脂肪から離れて小腸をいじめるために鉗子を使用してください。
腸を伸ばし、きれいな実験室のワイプの上に置きます。定規の尺度で、小腸の遠位回腸の4センチメートルを切断します。腸の1センチメートルを切断し、盲腸に近い。
腸内細菌を収集するために使用されるイリウムの3センチメートルの部分が残されます。2ミリリットルの滅菌チューブの上に回腸部分を保持します。直接腸を押し出し、チューブ内のサンプルを収集することによって腸の内容を収集します。
このサンプルは、回腸含有量からの細菌を有するであろう。冷たいリン酸緩衝生理食塩水で20ミリリットルのシリンジを調製し、流れを捨てる回腸部分を洗い流します。滅菌ペトリ皿の上に回腸部分を置き、ハサミで縦に開きます。
メスで回腸壁の内側を削ります。きれいな遠心分離管の上にPBSの1ミリリットルでそれを洗浄することによってメスに任意の細菌を収集します。細菌をペレットにするために5分間Gの8000倍で回転する。
遠心分離後、上清を捨てる。このサンプルには、回腸壁からの細菌が含まれます。便および回腸からのサンプルを含む管を秤量する。
空のチューブから重量を引いて、各サンプルの便の重量を求める。市販キットを使用して、便、イリウム含量、およびイリウム壁サンプルから細菌DNAを抽出します。使用するまで、DNAサンプルをマイナス20°Cで保存します。
氷上で市販のキットからqPCR標準、フェカルサンプルDNAおよびqPCR試薬を解凍します。滅菌DNAフリーウォーターの標準を10から7〜10の範囲で希釈し、マイクロリットル当たり2部にします。フェカルサンプルDNAを半分、5分の1、10分の1の濃度に希釈します。
その後、反応の合計数に1を加えたマスターミックス反応を行います。30マイクロリットルのマスターミックスとテンプレートの5マイクロリットルを混合し、これは、ネガティブコントロールのための標準、サンプルまたは水のいずれかである。次に、この混合物の10マイクロリットルを384ウェル光学qPCRプレートに各ウェルに加えます。
各反応を三重で行います。qPCRプレートと遠心分離機を短時間シールします。次に、技術プロトコルに記載されているとおりにプログラムされている qPCR マシンにプレートをロードします。
最後に、標準とサンプルのサイクルしきい値を取得してから、フェカルサンプルの16S rDNAコピー番号を計算します。代表的な結果は、経口ギャージまたは飲料水を介して抗生物質を投与した後のマウスにおける体重減少を示す。経口ギャージによって抗生物質を受けるマウスでは顕著な体重減少は検出されない。
マウスが飲料水中の抗生物質で治療されると、治療の最初の数日以内に体重の約10%が緩むが、その後正常な体重増加を回復する。便サンプル中の細菌の定量化には、qPCRで得られたC-T値に対して標準のコピー数の対数をプロットすることによって得られる標準曲線を使用する必要があります。線形範囲内では、回帰分析式により、フェカルサンプル内の16S rDNA量の定量が可能になります。
便、小腸の内容および小腸壁試料についてここに示すように。経口抗生物質投与の5日または10日後には、抗生物質処理マウス由来の便サンプル中の細菌の密度が強く低下する。しかし、抗生物質投与が停止した1週間後に正常なレベルに回復したフェース中の細菌の密度。
経口のギャバジと飲料水中の抗生物質の投与は、治療されたマウスの便細菌負荷を短時間減少させる。治療期間などの要因を考慮して、実験要件により適した個々の方法を選択する研究者。細菌の定量のためのqPCR法は、特定のプライマーを使用して個々の細菌分類を定量するために変更することができます。
これは、マイクロバイオームのサイズと組成に関する定量的および質的な情報の両方を提供します。
