이 프로토콜은 경구 항생제 투여 에 따른 마우스의 장 내 미생물제 변화를 정량화하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 이것은 선동적인 장 질병과 같은 미생물 dysbiosis와 관련되었던 병리에 있는 통찰력을 제공하는 교차 microbiota 상호 작용에 대한 연구를 도울 수 있습니다. 이러한 항생제 치료 정권의 주요 장점은 일반적으로 마우스에 경구 항생제 투여와 관련된 특성 체중 감소를 방지한다는 것입니다.
경구 개비지를 통해 항생제 치료를 개혁하기 위해 기술 프로토콜에 설명된 대로 준비된 스톡 솔루션을 혼합하여 항생제의 칵테일을 준비한다. 밀리리터 믹스 50 암피실린 마이크로리터, 젠타미신 50 마이크로리터, 네오마이신 50 마이크로리터, 500 마이크로리터 의 메트로니다졸, 25 개의 반코미신 및 325 마이크로 리터의 물. 항생제 믹스를 1밀리리터 주사기에 적재하고 거품을 제거하고 적절한 게이지 게이지 바늘을 부착합니다.
마우스 어깨 위에 피부를 단단히 잡고 머리와 목을 스트레칭하여 식도를 곧게 펴습니다. 입의 지붕을 따라 그리고 인두 뒤쪽으로 먹이 바늘의 볼 끝을 지시합니다. 그런 다음 식도에 부드럽게 전달하고 200 마이크로 리터의 용액을 주입하십시오.
실험 기간 동안 매일 항생제 칵테일을 투여하십시오. 또는 식수를 통해 항생제를 투여하기 위해 기술 프로토콜에 설명된 항생제 칵테일을 준비하십시오. 이것은 마우스 탈수를 방지하기 위하여 결정적인 요인이기 때문에 항생제 혼합물에 감미료를 포함하는 것이 중요합니다.
항생제 칵테일을 병당 약 100 밀리리터로 물병에 넣습니다. 병에 가볍고 마우스 케이지에 배치하십시오. 실험 기간 동안 항생제 칵테일을 일주일에 두 번 신선한 육수로 대체하십시오.
마우스 무게와 일반적인 건강 상태의 주의 깊은 모니터링은 항생제 투여 를 통해 매일 미리 형성되어야합니다. 샘플 수집을 위해 2밀리리터 오토클레이브 튜브의 무게를 측정하고 라벨을 부착합니다. 신선한 대변 샘플의 컬렉션은 억제제에 각 마우스를 배치합니다.
그런 다음 수집 튜브에서 항문에서 직접 배설물 펠릿을 수집합니다. 기술 프로토콜에 설명된 바와 같이 안락사를 수행한 후 복부가 완전히 노출된 마우스 시체를 낳고 70%에탄올로 복부 부위를 분사한다. 멸균 된 집게와 가위를 사용하면 복부에 횡절개를하여 내부 조직을 손상시키지 않고 페라테늄을 노출시합니다.
페라테늄을 들어 올리고 내장을 노출하기 위해 절개를합니다. 집게와 가위로 내장을 제거하고 멸균 페트리 접시에 놓습니다. 조심스럽게 막힘 동맥과 지방에서 소장을 애타게하는 집게를 사용합니다.
내장을 확장하고 깨끗한 실험실 닦아에 놓습니다. 통치자 측정과 소장의 말단 일체의 4 센티미터를 잘라. 절단하고 cecum에 내장 근위1 센티미터를 폐기.
장 내 세균을 수집하는 데 사용되는 장왼쪽 의 3 센티미터 부분이있을 것입니다. 2 밀리리터 멸균 튜브 위에 ileum 부분을 누릅니다. 내장을 직접 압출하고 튜브에서 샘플을 수집하여 장 함량을 수집합니다.
이 샘플은 ileum 함량에서 박테리아를 가질 것이다. 차가운 인산염 완충식식염으로 20 밀리리터 주사기를 준비하고 흐름을 버리는 일루를 플러시합니다. 멸균 페트리 접시에 ileum 부분을 놓고 가위로 세로로 엽니다.
테리움 벽의 내부를 메스로 긁어냅니다. 깨끗한 원심분리기 튜브 위에 PBS 1밀리리터로 세척하여 메스에 박테리아를 수집합니다. 박테리아를 펠릿 5 분 동안 8천 번 G에서 회전.
원심분리에 따라 상체가 폐기됩니다. 이 샘플은 ileum 벽에서 박테리아를 포함 합니다. 대변과 일루에서 샘플을 포함하는 튜브를 무게.
각 샘플에서 배설물 무게를 얻기 위해 빈 튜브에서 무게를 빼냅니다. 시판되는 키트를 사용하여 대변, ileum 함량 및 ileum 벽 샘플에서 세균 DNA를 추출합니다. 사용 전까지 DNA 샘플을 영하 20도에서 보관하십시오.
qPCR 표준, 대변 샘플 DNA 및 qPCR 시약을 얼음에 시판되는 키트에서 해동하십시오. 10에서 7에서 10까지의 범위에서 미생물 DNA 없는 물에 있는 표준을 마이크로리터 당 2개의 사본에 희석시 희석시. 배설물 샘플 DNA를 반, 15및 10분의 1 농도로 희석시.
그런 다음 총 반응 수와 1개에 대한 마스터 믹스 반응을 만듭니다. 마스터 믹스의 마이크로리터 30개와 네거티브 컨트롤을 위한 표준, 샘플 또는 물인 템플릿의 마이크로리터 5개들을 혼합합니다. 그런 다음 384 개의 잘 광학 qPCR 플레이트에 이 믹스의 10 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다.
트리플리케이트로 각 반응을 수행합니다. qPCR 플레이트와 원심분리기를 간단히 밀봉합니다. 그런 다음 기술 프로토콜에 나열된 대로 프로그래밍된 qPCR 컴퓨터에 플레이트를 로드합니다.
마지막으로 배설물 샘플에 대한 16S rDNA 복사 번호를 계산하기 전에 표준 및 샘플에 대한 사이클 임계값값을 가져옵니다. 대표적인 결과는 구강 개비에 의한 항생제 투여 후 또는 식수를 통해 마우스에서 체중 감소를 나타낸다. 구강 개비에 의해 항생제를 받는 마우스에서는 눈에 띄는 체중 감소가 발견되지 않습니다.
마우스가 식수에서 항생제로 치료될 때 치료 후 정상적인 체중 증가를 회복하는 첫 며칠 이내에 체중의 약 10 %를 느슨하게합니다. 배설물 시료에서 박테리아의 정량화는 qPCR에서 얻은 C-T 값과 표준에 대한 복사 수의 logarithm을 플로팅하여 얻은 표준 곡선의 사용을 요구한다. 선형 범위 내에서 회귀 분석 방정식은 배설물 샘플 내에서 16S rDNA 풍부를 정량화할 수 있게 한다.
대변, 소장 함량 및 소장 벽 샘플에 대해 여기에 표시된 바와 같이. 경구 항생제 투여 5 일 또는 10 일 후에 항생제 처리된 마우스에서 대변 견본에 있는 박테리아의 밀도에 있는 강한 감소가 있습니다. 그러나 대변에 있는 박테리아의 조밀도는 항생제 행정이 중단된 후에 1 주일 정상 수준으로 회복되었습니다.
구강 개간및 식수내 항생제 투여모두 처리된 마우스의 배설물 세균 부하를 잠시 감소시다. 치료 기간과 같은 요인을 고려하여 실험 요구 사항에 더 잘 맞는 개별 방법을 선택하는 연구원. 박테리아의 정량화를 위한 qPCR 방법은 특정 프라이머를 사용하여 개별 세균성 택시를 정량화하도록 수정될 수 있다.
이것은 미생물군유전체 크기와 조성에 대한 정량적 및 자질 정보를 모두 제공합니다.
