ここでは、NETSおよび免疫蛍光画像を定量化するための完全に自動化されたアプローチであるNETQUANTを紹介します。これにより、研究者は複数のユーザーや条件によって生成されたデータから同等の画像解析を行うことができます。この手法の利点は、使いやすさ、単一細胞データ分析、NET 形成を評価する複数の基準、および複数の画像の公平な分析です。
解析ソフトウェアをインストールして開きます。最新バージョンは、ゼノドGitHubアーカイブ、またはノルドンフェルトラボのウェブサイトで見つけることができます。[設定] タブで、ソース メニューの [パスの取得] オプションをクリックして、分析するソース フォルダを選択します。
解析するイメージ シーケンスを含むフォルダを選択します。再度、ターゲットメニューの「パスを取得」オプションをクリックし、画像分析後にデータを保存するターゲットフォルダーを選択します。次に、別々のチャンネル画像を使用する場合、DNAチャネルが核DNA染色に対応するようにチャンネルフォルダに名前を付け、NETチャンネルは画像内の好中球エラスターゼ染色を描写する。
また、コントロール イメージ ファイルを含むフォルダーにコントロールの名前を付けます。次に、画像情報の読み込みボタンをクリックし、イメージメタデータをソフトウェアにロードします。次に、チャンネルオーダーサブメニューで、画像に含まれる正しいチャンネル順序を選択します。
これは、偶発的な不一致を防ぐのに役立ちます。次に、[データの準備] ボタンをクリックして、生データからプライマリ画像プロパティを取得し、画像を変換します。変換後の画像は、サンプルタイプのサブメニューに表示されます。
サンプルタイプメニューをクリックし、サブメニューから画像を選択し、ディスプレイ画像データをクリックして、DNAと好中球外細胞トラップ、またはNETチャンネルに分割された画像をそれぞれ表示します。細胞をそれぞれのチャンネルに分割するには、セグメンテーション方法タブを選択し、DNAとNETチャンネルの両方の方法サブメニューで方法を選択します。セグメンテーションの既定の方法はアダプティブに設定されており、推奨される設定です。
その他のオプションは、グローバルエッジやチャンバースを含むソフトウェアで利用可能です。近くに配置されたセルと NET を区別するために、流域オプションも含まれています。また、セグメンテーション タブで、セグメント制御サンプル オプションをクリックします。
次に、サンプル・タイプ・サブメニューから PMA を選択し、バッチ・オプションをクリックして、データ・セットに含まれるすべてのイメージのセグメンテーションを開始します。次に、サンプルタイプメニューで画像を選択し、表示画像データボタンをクリックして、セグメンテーション後に生成されたDNAマスクとNETマスクの両方のバイナリ画像マスクを視覚化して検証します。次に、解析タブで、制御サンプルを分析するしきい値の決定ボタンをクリックします。
次に、右側でサンプルタイプをPMAに変更し、細胞プロパティの取得ボタンをクリックして、刺激されたサンプルの分析を完了します。次に、サンプルタイプのサブメニューから画像を選択し、画像データ表示ボタンをクリックして、画像内のオーバーレイとセル数とNETフォームセル数を表示します。まず、サンプルタイプのサブメニューからサンプルを選択します。
個々の画像は、分析用のサンプルタイプのサブメニューから選択するか、バッチオプションを選択して画像のバッチ全体を分析することができます。選択したら、[NET の解析] ボタンをクリックして解析を完了します。NET 基準を手動で調整して、特定のサンプルに最適な結果を得ることができます。
識別された NET と元の画像を比較して、識別の品質を評価します。この手順が完了すると、データセット内のすべての画像に NET 条件を適用できます。また、NET 基準に対する変更は、すべてのコントロール サンプルにも同時に適用されます。
セル データ サブメニューで、画像の数、画像あたりのセル数、および画像ごとの NET の割合が表示されるデータの概要を調べます。出力タブを入力して、結果の出力を選択して表示します。出力の形式を選択して出力結果ボタンをクリックすることにより、制御およびPMA処理サンプルの分析から生成された各種データ出力を探索し、比較します。
次に、結果データテーブルCSVファイルを起動して単一細胞データを探索し、結果PDFファイルをクリックして、サンプル内のNETエリア分布とDNA対NET比を視覚化します。赤い線はグラフのしきい値を示します。最後に、結果の二変量分布ファイルをクリックして、NET領域とDNAの形状を決定します。
ここでは、制御好中球の15画像およびPMA刺激好中球の15画像を10分以内に分析した。細胞の総数をカウントし、好中球外細胞トラップを有する細胞の割合は、この記事で説明した自動化された定量方法を使用して決定した。これらの結果は、PMA刺激性好中球が、コントロールサンプルよりも大きな面積、核変形の増加、およびDNA対NET比が高いことを示している。
3D グラフに組み合わせると、PMA 刺激サンプルは、コントロール サンプルよりも引き締めグループの領域を示す傾向があります。手順を試みる際は、ワークフローは複数のドナーを使用してテストされましたが、個々のデータセットに基づいてソフトウェアパラメータを適切に決定することをお勧めします。
