在这里，我们介绍 NETQUANT，一种全自动的方法，用于量化 NETS 和免疫荧光图像。这将有助于研究人员根据多个用户和条件生成的数据进行可比较的图像分析。该技术的优点是易用性、单细胞数据分析、评估NET形成的多种标准以及对多个图像的公正分析。
安装并打开分析软件。可以在 Zenodo GitHub 存档或诺顿费尔特实验室网站上找到最新版本。在"设置"选项卡中，通过单击源菜单中的 get 路径选项选择源文件夹进行分析。
选择要分析的图像序列的文件夹。同样，单击目标菜单中的 get 路径选项，然后选择目标文件夹以在图像分析后保存数据。接下来，当使用单独的通道图像时，命名通道文件夹，使DNA通道与核DNA染色相对应，NET通道描绘图像中的中性粒细胞弹性酶染色。
此外，将包含控件图像文件的文件夹名称为控件。接下来，单击加载图像信息按钮，将图像元数据加载到软件中。然后在通道顺序子菜单中，选择图像中包含的正确通道顺序。
这有助于防止意外不匹配。现在单击准备数据按钮从原始数据获取主图像属性并转换图像。然后，转换后的图像将显示在示例类型子菜单中。
单击示例类型菜单，从子菜单中选择一个图像，然后单击显示图像数据，以显示分别拆分为 DNA 和中性粒细胞外陷阱或 NET 通道的图像。要将细胞分段到各自的通道中，请选择分段方法选项卡，并在方法子菜单中为 DNA 和 NET 通道选择一个方法。默认的分段方法设置为自适应，是推荐的设置。
软件中还有其他选项，包括全局边缘和 chanverse。还包括了一个分水岭选项，以帮助区分放置紧密的细胞或NET。此外，在分段选项卡中，单击分段控件示例选项。
然后从示例类型子菜单中选择 PMA，然后单击批处理选项，开始分割数据集中包含的所有图像。接下来，选择示例类型菜单中的图像，然后单击显示图像数据按钮，以可视化和验证分割后生成的 DNA 和 NET 蒙版的二进制图像蒙版。现在，在分析选项卡中，单击确定阈值按钮以分析控制样本。
然后，在右侧将样本类型更改为 PMA，然后单击 get 单元格属性按钮以完成对受刺激样本的分析。接下来，从示例类型子菜单中选择一个图像，然后单击显示图像数据按钮以显示图像中的叠加以及单元格数和 NET 成形单元格的数量。首先从示例类型子菜单中选择示例。
可以从样本类型子菜单中选择单个图像进行分析，也可以通过选择批处理选项分析整个图像批次。选择后，单击分析 NETs 按钮以完成分析。手动调整 NET 条件，为给定样本生成最佳结果。
将已识别的 性 性 内与原始图像进行比较，以评估识别质量。完成此步骤后，可以在数据集中的所有图像中应用 NET 条件。对 NET 条件所做的任何更改也同时应用于所有控制示例。
检查单元格数据子菜单中的数据摘要，其中显示图像数、每个图像的单元格数和每个图像的 NET 百分比。输入输出选项卡以选择和查看结果输出。通过选择输出的形式并单击输出结果按钮，探索并比较从控制和 PMA 处理样本分析中生成的各种数据输出。
接下来，启动结果数据表 CSV 文件以探索单单元数据，然后单击结果 PDF 文件以可视化样本中的 NET 区域分布和 DNA 与 NET 比率。红线表示图形中的阈值。最后，单击结果双变量分布文件以确定 DNA 的 NET 区域与形状。
在这里，在10分钟内分析了15张控制性嗜中性粒细胞图像和15张PMA刺激的嗜中性粒细胞图像。使用本文中描述的自动定量方法计算细胞总数，确定具有中性粒细胞外陷阱的细胞百分比。这些结果表明，PMA刺激的嗜中性粒细胞具有较大的面积，核变形的增加，并且与对照样品的DNA与NET比更高。
当组合成 3D 图形时，PMA 刺激的样本往往比对照样本显示紧固分组的区域。在尝试该过程时，必须记住，尽管工作流是使用多个捐赠者测试的，但建议用户根据单个数据集适当地决定软件参数。
