Aquí presentamos NETQUANT, un enfoque totalmente automatizado para cuantificar NETS y las imágenes de inmunofluorescencia. Esto ayudará a los investigadores a realizar análisis de imágenes comparables a partir de datos generados por múltiples usuarios y condiciones. Las ventajas de esta técnica son la facilidad de uso, el análisis de datos de una sola célula, múltiples criterios para evaluar la formación de NET y un análisis imparcial de varias imágenes.
Instale y abra el software de análisis. Se puede encontrar una versión actualizada en el archivo GitHub de Zenodo o en el sitio web de Nordonfelt Lab. En la pestaña de configuración, elija una carpeta de origen para el análisis haciendo clic en la opción obtener ruta en el menú de origen.
Seleccione la carpeta que contiene las secuencias de imágenes que se van a analizar. Una vez más, haga clic en la opción obtener ruta en el menú de destino y seleccione la carpeta de destino para guardar los datos después del análisis de imagen. A continuación, cuando utilice imágenes de canal separadas, asigne un nombre a las carpetas del canal para que el canal de ADN se corresponda con la mancha de ADN nuclear, y el canal NET representa la mancha de elastasa de neutrófilos en las imágenes.
Además, asigne un nombre a la carpeta que contiene los archivos de imagen de control como control. A continuación, haga clic en el botón cargar información de imagen y cargue los metadatos de la imagen en el software. A continuación, en el submenú Orden de canal, seleccione el orden de canal correcto contenido en las imágenes.
Esto ayuda a evitar desajustes accidentales. Ahora haga clic en el botón preparar datos para adquirir las propiedades de imagen primarias de los datos sin procesar y convertir las imágenes. Las imágenes convertidas aparecerán en el submenú Tipos de muestra.
Haga clic en el menú de tipo de muestra, seleccione una imagen del submenú y haga clic en mostrar los datos de la imagen para mostrar las imágenes divididas en el ADN y Neutrophil Trampa extracelular, o canal NET, respectivamente. Para segmentar las celdas en sus respectivos canales, seleccione la pestaña Método de segmentación y seleccione un método en el submenú del método para los canales DNA y NET. El método predeterminado de segmentación se establece en adaptable y es la configuración recomendada.
Otras opciones están disponibles en el software, incluyendo borde global y chanverse. También se ha incluido una opción de cuenca hidrográfica para ayudar a distinguir entre células estrechamente colocadas o NEA. También en la pestaña de segmentación, haga clic en la opción de muestras de control de segmento.
A continuación, seleccione PMA en el submenú de tipo de muestra y haga clic en la opción de lote para comenzar la segmentación de todas las imágenes incluidas en el conjunto de datos. A continuación, seleccione las imágenes en el menú de tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para visualizar y validar las máscaras de imagen binaria para las máscaras de ADN y NET generadas después de la segmentación. Ahora, en la pestaña de análisis, haga clic en el botón determinar umbral para analizar las muestras de control.
Luego, en el lado derecho, cambie el tipo de muestra a PMA y haga clic en el botón Obtener propiedades de celda para completar el análisis de las muestras estimuladas. A continuación, seleccione una imagen del submenú Tipo de muestra y haga clic en el botón Mostrar datos de imagen para mostrar la superposición y el número de celdas y celdas de conformar mosquio en la imagen. Comience seleccionando la muestra en el submenú Tipo de muestra.
Las imágenes individuales se pueden seleccionar en el submenú de tipo de muestra para el análisis o se puede analizar todo el lote de imágenes seleccionando la opción de lote. Una vez seleccionado, haga clic en el botón analizar NETs para completar el análisis. Ajuste los criterios de NET manualmente para obtener resultados óptimos para una muestra determinada.
Compare los NT identificados con las imágenes originales para evaluar la calidad de la identificación. Una vez completado este paso, los criterios de NET se pueden aplicar a todas las imágenes del conjunto de datos. Los cambios realizados en los criterios de NET también se aplican simultáneamente a todos los ejemplos de control.
Inspeccione el resumen de datos en el submenú de datos de celda, donde se muestra el número de imágenes, el recuento de celdas por imagen y el porcentaje de NIT por imagen. Introduzca la pestaña de salida para seleccionar y ver las salidas de resultados. Explore y compare las diversas salidas de datos generadas a partir del análisis de muestras de control y tratadas con PMA seleccionando la forma de la salida y haciendo clic en el botón de resultados de salida.
A continuación, inicie el archivo CSV de la tabla de datos de resultados para explorar los datos de una sola celda y haga clic en los archivos PDF de resultados para visualizar la distribución del área NET y la relación DNA a NET en los ejemplos. La línea roja indica el valor de umbral en los gráficos. Por último, haga clic en el archivo de distribución bivariada de resultados para determinar el área NET frente a la forma del ADN.
Aquí, se analizaron 15 imágenes de neutrófilos de control y 15 imágenes de neutrófilos estimulados por PMA en menos de diez minutos. Se contó el número total de células y se determinó el porcentaje de células con trampas extracelulares de neutrófilos utilizando el método de cuantificación automatizado descrito en este artículo. Estos resultados muestran que los neutrófilos estimulados por PMA tienen un área más grande, un aumento en la deformación nuclear y una relación ADN a NET más alta que las muestras de control.
Cuando se combinan en un gráfico 3D, las muestras estimuladas por PMA tienden a mostrar áreas de agrupaciones de apriete que las muestras de control. Al intentar el procedimiento, es importante recordar que aunque el flujo de trabajo se probó con varios donantes, se recomienda que el usuario decida los parámetros de software adecuadamente en función del conjunto de datos individual.
