このプロトコルは、好中球細胞外トラップの組成、構造、および形態の不均一性を、健康な個体からのヒト好中球における同等のin vitro条件下での誘導刺激に応じて実証します。高い好中球純度および生存率が得られる。これにより、好中球細胞外トラップによって放出されるDNA、LL-37、およびミエロペルオキシダーゼ、エラスターゼ、およびカテプシンGの酵素活性の濃度を比較することができます。
このプロトコルは、自己免疫疾患におけるNETの産生に対する可溶性因子または細胞接触または可能な治療法または閉鎖メカニズムの効果を分析することを可能にした。これらの方法は、自己免疫疾患の調査に役立ちます。NETの制御されていない細胞再生およびそれらの成分の整列期間のために、これらは疾患のバイオマーカーと考えられている。
蛍光顕微鏡は、微生物と共局在するLL37などのタンパク質と結合したDNAの分散を示すNETの画像をキャプチャし、それらがどのように出現しているかを理解するのに役立ちます。まず、静脈穿刺を行い、抗凝固剤として二カリウムEDTAを含むチューブに10ミリリットルの末梢血を採取します。次に、標準的な血液バイオメトリーとC反応性タンパク質検査を実行して、感染や炎症を除外し、サンプルの品質を確保します。
末梢血サンプルを遠心分離して多血小板血漿を除去し、続いて2回目の遠心分離を行い、残りの血漿を廃棄する。得られた赤血球と白血球のパッケージを1つの1X DPBSで1対1の体積比で希釈します。次いで、滅菌10ミリリットルのガラス管中に、最初に1ミリリットルの1ミリリットルの1.08グラムの密度溶液を堆積させ、続いて1ミリリットルの1ミリリットルの1.079グラムの密度溶液を堆積させる。
次に、壁に注ぐことによって、4ミリリットルの希釈赤血球と白血球のパッケージを追加します。勾配を乱さないように、加速または減速せずに遠心分離します。顆粒球に対応する相を吸引し、別の滅菌10ミリリットルガラス管に移します。
4ミリリットルの1X DPBSで300Gで摂氏4度で10分間洗浄し、上清を廃棄します。残りの赤血球を除去するには、4ミリリットルの0.2%生理食塩水を加えて細胞を浸透圧ショックで処理します。摂氏4度で2分間インキュベートし、遠心分離します。
上清を廃棄し、4ミリリットルの0.65%食塩水を加える。摂氏4度で5分間インキュベートして膜の完全性を回復し、遠心分離を繰り返します。上清を除去し、細胞を4ミリリットルの1X DPBSに再懸濁して、細胞の破片を除去します。
再度、遠心分離し、細胞ペレットを2ミリリットルの冷たいHBSSバッファーに再懸濁する。トリパンブルー排除試験を実施するには、5マイクロリットルの細胞懸濁液を20マイクロリットルの0.4%トリパンブルーで希釈します。新しいバウアーチャンバー内の細胞をカウントし、除外テストを使用して細胞の生存率を決定します。
次に、5マイクロリットルの細胞懸濁液をスライドにマウントし、ライト染色剤で15秒間染色します。直ちに試料を固定し、蒸留水で洗浄し、光学顕微鏡で形態を観察します。次に、フローサイトメトリーチューブに5番目の細胞に10回10を加え、100マイクロリットルのFACSバッファーに1マイクロリットルの7AADで摂氏4度の暗所で15分間染色します。
500マイクロリットルのFACSバッファーで300 Gで10分間洗浄します。細胞を500マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー分析まで摂氏4度で保存します。死細胞コントロールのために、細胞を200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで30分間固定し、500マイクロリットルの1XPBSで300Gで摂氏4度で10分間洗浄します。
上清を廃棄し、200マイクロリットルの0.1%Triton X-100を追加します。摂氏4度で1時間インキュベートします。500マイクロリットルの1X PBSで洗浄し、7AADで染色します。
キャプチャしたデータをフローサイトメーターソフトウェアで解析します。ファイルをロードし、染色されていない好中球ファイルをダブルクリックします。X軸に前方散乱またはFSC、Y軸に側方散乱またはSSCを選択して、好中球に対応する細胞集団を表示します。
次に、X軸でチャンネルB3-A:PerCP vio 700-Aを選択して細胞の自家蛍光を絞り出し、Y軸でヒストグラムを選択します。次に、染色した好中球ファイルを開きます。X軸にFSC、Y軸にSSCを選択して、好中球に対応する細胞集団を表示します。
ここでも、チャネルB3-A:PerCP vio 700-Aを選択して、色素7AAD陽性の好中球の集団を区切る。最終的なヒストグラムを生成するには、ウィンドウを右クリックし、[レイアウト エディターにコピー] を選択します。1.5ミリリットルのマイクロチューブに細菌性または真菌性の偽菌糸を加えます。
200マイクロリットルを追加するので、1X PBSに5マイクロモルのCFSCを追加します。暗所で10分間摂氏37度で混合してインキュベートします。500マイクロリットルの脱補血漿と遠心分離機を加えて反応を停止します。
上清を捨て、遠心分離しながら1ミリリットルの1XPBSでペレットを洗浄する。次に、微生物を250マイクロリットルの1X PBSに再懸濁します。NET誘導のために、10〜7番目の細菌の2倍または10〜5番目の偽菌糸を含む1.5ミリリットルのマイクロチューブに50マイクロリットルのアリコートを準備します。
10 x 10ミリメートルの滅菌ガラスカバースリップを24ウェルプレートに入れます。10マイクロリットルの0.001%ポリl-リジンで室温で1時間覆い、100マイクロリットルの1X PBSで2回洗浄します。風乾し、UV光を15分間照射します。
次に、先に調製した好中球懸濁液のHBSS溶液を、10%熱脱離した自家血漿を添加したRPMI 1640培地に交換する。この細胞懸濁液を350マイクロリットルを24ウェルプレートに加え、ウェルあたり10〜5番目の好中球の2倍の最終濃度にします。プレートを摂氏37度で20分間、5%二酸化炭素でインキュベートして、細胞がウェルの底に付着できるようにします。
網形成を誘導するには、細菌刺激MOI100と偽菌糸をMOI1に追加します。また、生化学的刺激を加え、50マイクロリットルのHBSSを加えることによって刺激のない対照を調製する。ウェルあたり400マイクロリットルの最終容量を取得し、プレートシェーカーで140 RPMで30秒間混合します。
その後、摂氏37度と5%二酸化炭素で4時間インキュベートします。ネット誘導後、慎重にピペッティングしてウェルから上清を取り除き、細胞を300マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで30分間固定します。遠心分離せずに200マイクロリットルの1X PBSで細胞を洗浄し、200マイクロリットルのブロッキングバッファーを30分間加えます。
LL37染色剤の場合、細胞を1X PBS中の0.2%Triton X-100の200マイクロリットルで10分間透過処理し、1X PBSで2回洗浄します。カバースリップをスライドガラスに取り付けます。DNAは2マイクロリットルのDAPIで細胞を染色し、共焦点蛍光顕微鏡による分析まで摂氏マイナス20度で保存します。
動的細胞相は、二重密度勾配精製後に視覚化されました。典型的な好中球形態は右染色により確認した。細胞はまた、膜破壊なしにトリパンブルー排除によって観察された最適な生存率を示した。
フローサイトメトリーによるSSC対FSCの分析により、高い細胞純度でPMNに対応する集団が確認されました。非染色細胞対7AAD染色細胞のPMNドットプロットおよびそれぞれのヒストグラムは、透過処理されたコントロール細胞と比較して、新たに単離された好中球において高い細胞生存率を示した。好中球を化学的および微生物刺激剤で刺激した後、DNA DPIおよび抗LL37を用いた蛍光顕微鏡法によってNETを可視化した。
微生物をCFSEで予め染色した。PMA誘発性自殺ネット形成は、LL37との共局在によって示されます。一方、HOCIで形成されたNETは、細胞外空間にわずかなDNA分散を示し、これは重要なNET形成に対応していました。
真菌偽菌糸によって誘導されたNETは、重要なNET形成に特徴的な糸状構造を有する細胞外空間に放出された低濃度のDNAを示した。黄色ブドウ球菌は重要なNET形成を示したが、緑膿菌はLL37と共局在する濁った形態で高濃度のDNAの放出を誘導し、自殺NET形成を示した。二重密度勾配法を行うことで、好中球の高純度と生存率を得ることができます。
そして私達は洗剤を高くします、私達はそれらの構造を傷つけません。この方法に従って、NET産生における物質または細胞の影響、およびそれらが何らかのメカニズムに関与しているかどうか、または自己免疫疾患の治療法としての使用を分析することができます。
