リアノジン受容体ドメインの構造を解くと、タンパク質機能の分子機構、殺虫剤作用、および殺虫剤耐性の開発の理解に役立ちます。この尺度は、ほぼ原子分解能でタンパク質構造決定のためのゴールドスタンダードと考えられている構造イラストのためのX線結晶学の使用を意味する。この高解像構造の昆虫リノジン受容体ドメインは、チャネル・ゲージのメカニズムを明らかにし、構造ベースの薬物設計アプローチを用いた種特異的殺虫剤の開発に重要なテンプレートを提供する。
一般的に、この方法に新しい個人は、将来のタンパク質結晶学者が生化学、生物物理学、コンピュータサイエンス、数学に堪能でなければならないので、苦労します。まず、ポリメラーゼ連鎖反応により目的のタンパク質に対応するDNAを増幅する。反応の最後に、2%アガロースゲル上で50マイクロリットルの反応ミックス全体を実行し、標準的なプロトコルに従ってゲル抽出キットでDNAを抽出します。
次に、20マイクロリットルの20マイクロリットルのベクターDNAを、10X反応バッファーの6マイクロリットルとSspI制限酵素の4マイクロリットルを30マイクロリットルの二重蒸留水に混合して、LICベクターDNAを直線化する。この反応混合物を摂氏37度で3時間インキュベートする。インキュベーションの最後に、反応ミックス全体を1%アガロースゲルで実行し、続いて、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用して線形化ベクターDNAを抽出します。
次に、標準的なプロトコルに従って、5マイクロリットルの線形化ベクターDNAとPCR増幅インサートDNAに対して、別々のT4 DNAポリメラーゼ処理を行う。室温で40分間インキュベートし、続いて摂氏75度で酵素熱不活性化を20分間行う。T4処理した2マイクロリットルのT4処理した挿入DNAを2マイクロリットルのT4処理LICベクターDNAと室温で10分間インキュベーションして結合することにより、ライゲーション非依存性クローニングアニーリング反応を行う。
BL21(DE3)E.大腸菌細胞を組換えプラスミドで変換し、氷上で50マイクロリットルのコンピテントセルを解凍し、約1マイクロリットルのアニールプラスミドをチューブに加えます。チューブを2~3回軽くフリックして細胞とDNAを混合し、チューブを氷の上に20分間戻します。
インキュベーションの終わりに、42°Cで細胞を熱ショックを与え、続いて氷の上に2分間戻ります。次に、室温LB培地を1ミリリットル加え、セルを摂氏37度で45分間250RPMシェーカーに置きます。揺れのインキュベーションの終わりに、この混合物の150〜200マイクロリットルを選択プレートにプレートし、37°Cで一晩プレートを反転させる。
翌日、カナマイシンを添加した2-YT培地の100ミリリットルの単一コロニーを、摂氏37度のシェーカーインキュベーターで一晩培養する。翌朝、1リットルの2-YT培地を接種し、カナマイシンを添加し、10ミリリットルの一晩培養を行い、OD600の読み取り値が約0.6に達するまで振盪して摂氏37度でインキュベートする。次いで、IPTGで培養した培養を0.4ミリモルの最終濃度に誘導し、30°Cで5時間細胞を増殖させる。
インキュベーションの終了時に、遠心分離により細胞を収穫し、そして、リシス緩衝液濃度の40ミリリットルあたり10グラムの細菌にペレットを再懸濁する。65%の振幅で超音波処理によって細胞壁を破壊し、1秒間オフに1秒間、8分間破壊する。遠心分離によって細胞の破片を取り除きます。
次に、22マイクロメートルのフィルターで上澄みをフィルターし、溶液をサンプルループにロードします。融合タンパク質を精製するには、サンプルループからろ過した上清を5ミリリットルのニッケルニトロロトリアセティックカラムに注入し、20~250ミリモルイミダゾールの線形勾配を有する精製システム上で行います。溶出した標的タンパク質をタバコエッチウイルスプロテアーゼで切断し、1〜50比で、摂氏4度で一晩、アミロース樹脂カラム上に切断反応混合物を精製し、ニッケル-ニトロロトリアセティックカラムとし、タグとタバコエッチングウイルスプロテアーゼを除去する。
塩濃度を下げるために、ニッケルニトロロトリアセクチカラムからの透析液を透析液バッファーに対して透析し、溶出バッファー内の20〜500ミリモル塩化カリウムの線形勾配によって陰イオン交換カラム上のサンプルを精製します。次に、遠心濃縮器にタンパク質を濃縮する。濃縮タンパク質をSuperdex 200 26/600ゲル濾過カラムに注入して均質性を確認し、タンパク質の純度を15%SDS-PAGEで評価します。
結晶化のためにタンパク質を調製するには、精製したタンパク質サンプルを遠心濃縮器に1ミリリットル当たり10ミリグラムに濃縮し、80°Cの貯蔵前に結晶化緩衝液にバッファー交換する。結晶化スクリーニングを行うために、295ケルビンのシッティングドロップ蒸気拡散法を使用し、いくつかの結晶化キットと、96ウェル形式の自動液体ハンドリングシステムを使用します。ドロップ設定の最後に、96ウェル結晶化プレートを密封して蒸発を防ぎ、そしてリザーババッファー内のタンパク質の滴下の平衡を可能にする。
プレートを18°Cの水晶インキュベーターに入れ。結晶の形成と成長を監視するために、定期的に光顕微鏡の下でプレートをチェックしてください。タンパク質結晶を塩結晶から分化するには、1マイクロリットルのタンパク質結晶色素をターゲットドロップに加え、1時間後に顕微鏡下で結晶を観察します。
タンパク質結晶が青色に表示されます。結晶をさらに最適化するには、24ウェルプレートで正の結晶化条件と吊り下げ液拡散法を使用し、続いて水晶インキュベーターで摂氏18度でインキュベートします。タンパク質の構造を決定するには、液体窒素でフラッシュ冷却するために光顕微鏡の下でクライオループに結晶を取り付け、貯蔵および輸送のためにユニバックに結晶を置きます。
手動センタリング機能を使用して、結晶をマウントし、中央に配置する、社内X線ディプラクタで結晶を事前にスクリーニングします。次に、X線回折ソフトウェアを使用してデータを収集します。HKL-2000 スイートを使用して、データ・セットの索引付け、統合、およびスケーリングを行う場合は、まず、ディテクタを選択し、データ・セットをロードします。
そして、ピーク探索機能を行い、回折スポットを見つける。スポットをインデックス化し、適切なスペース グループを選択し、ピーク統合を実行します。次に、データセットをスケールします。
エラーモデルを調整し、再度スケールします。出力 sca ファイルを保存します。Phenix ソフトウェア・スイートを使用して構造を判別するには、新しいプロジェクトを作成します。
まず、scaファイルでExtriageを実行して、非対称単位内のタンパク質分子の可能なコピー数を計算します。次に、分子置換によって位相問題を解決し、Phaserを実行し、回折データファイルを用いて、標的タンパク質として高配列同一性および構造類似性を有するテンプレート構造ファイル、およびタンパク質配列ファイルを、溶液を見つける。Phenixで自動構築を実行し、Phaserの出力ファイルとターゲットタンパク質のシーケンスファイルを使用して初期モデルを生成します。
手動で、COOTを使用して改変実験電子密度に構造を構築し、反復サイクルでのPhenix精製を使用して精製します。Phenix の検証ツールを使用して、最終的なモデルを検証します。本代表的実験では、ダイヤモンドバックガ・リアノジン受容体タンパク質の末端ドメインの精製が実証されるように、STS-PAGE分析により約21キロダルトンで単一バンドを生じた。
ゲル濾過カラムからの溶出体積は、精製されたリヨジン受容体末端ドメインがモノマーであることを確認した。結晶化のために、高品質の板状結晶が形成された最も最適な条件は、pHの1モルHEPESが7、および1.6モル硫酸アンモニウムの存在下にあった。実証されたソフトウェアを利用した回折データセットからのタンパク質構造の決定は、残基1〜205をカバーするダイヤモンドバックガ・リアノジン受容体末端ドメインを明らかにした。
大きな障害、柔軟な領域、または弱い親和性を有するタンパク質は、結晶化に挑戦しています。これらのシナリオでは、表面エントロピーの減少、ループ切り捨て、架橋などのタンパク質工学戦略は、より良いタンパク質結晶を得る可能性を高める可能性があります。高解像度のタンパク質構造を明らかにすることに加えて、X線結晶学は、構造ベースの農薬設計に役立つタンパク質と農薬の相互作用を研究するためにも使用される可能性があります。
