このプロトコルは、AFMのすべての主要な機能を利用し、他の単一分子技術には非適当である。その結果、核組の構造をナノスケールで解決することが可能です。重要なことに、ヌクレオソームの直接可視化は生理学的条件下で行われた。
我々のAFM技術を用いて、我々は最近、中心全体の機能に役割を果たすことができるセントロメアヌクレオソームのユニークな特性を明らかにした。現在、アミロイド凝集体の形成に関連するタンパク質の自己集合性を調べる方法が、当社の研究室で適用されています。これらのタンパク質凝集体は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの壊滅的な疾患の発症を引き起こします。
また、単純な調製方法は、DNA複製機械などの大規模なシステムを含む他のタンパク質-DNA複合体にも適用可能です。いくつかの変更が必要ですが。静的およびタイムラプス原子間力顕微鏡を用いて単一分子レベルで核子粒子を特徴付けるためには、添付のテキストプロトコルに記載されているように、ヌクレオソームを精製、組み立て、検証することから始めます。
次に、静止AFMイメージング用のマイカ表面を準備します。これを行うには、まず50ミリモルAPSストック溶液を脱イオン水に調製します。必要になるまで、この溶液の1ミリリットルのアリコートを摂氏4度で保管してください。
ストック溶液から、50マイクロモルAPSストックの50マイクロリットルを蒸留脱イオン水の15ミリリットルに溶解して、マイカ改質のための働くAPS溶液を調製する。溶液を混合し、その後、溶液でキュベットを充填します。次に、高品質のマイカシートからマイカのストリップを3センチメートルずつカットします。
キュベットに斜めに置くと、ピースが収まることを確認してください。その後、両面が切断されるまでマイカの層を切断し、ピースは0.1ミリメートルと同じくらい薄いです。すぐに、APS充填キュベットにマイカピースを入れ、30分間インキュベートします。
マイカピースを蒸留脱イオン水で満たされたキュベットに移し、30秒間浸します。次に、アルゴンを使用してAPSマイカストリップの両側を完全に乾燥させます。いくつかの磁気パックに二重面粘着テープを適用し、側面にそれらを配置します。
その後、APSマイカ基板を1センチメートルの正方形に1センチメートルにカットし、きれいなペトリ皿でそれらをカバーします。次に、10ミリモルヘープと4ミリモルの塩化マグネシウムを含む0.22ミクロンの濾過バッファーを用いて、組み立てられたヌクレオソームの3つの希釈液を、PH7.5で調製する。ヌクレオソームの損失を制限するために、低い最終濃度で、希釈はAPSマイカに堆積する直前に一度に1つずつ行われるべきである。
APSマイカ片の中心に各ヌクレオソームサンプルの5〜10マイクロリットルを堆積させ、2分間インキュベートさせます。次に、2~3ミリリットルの蒸留脱イオン水でサンプルを穏やかにリンスし、緩衝成分を除去します。そして、アルゴンの光の流れの下で堆積したサンプルを乾燥させます。
まず、AFM セットアップのチップホルダーにチップを取り付けます。次に、AFMステージに第1サンプルを取り付け、サンプル表面に接触しないように注意する。レーザーをカンチレバーの上に置き、その合計が最大になるまで、垂直および横方向のたわみ値をゼロ近くに調整します。
次に、AFMプローブを調整して共振周波数を見つけ、ドライブの振幅を調整し、画像サイズを100 x 100ナノメートルに設定します。設定が完了したら、エンゲージ ボタンをクリックしてアプローチを開始します。アプローチが完了したら、サンプルの表面がはっきりと見えるまで、振幅設定点を徐々に最適化します。
次に、スキャンサイズを 1 ミクロンに 1 ミクロン、解像度を 512 x 512 ピクセルに増やします。最後に、キャプチャ ボタンをクリックして、画像の取得を開始します。ガラスロッドスキャナー接着剤を使用して、ガラスロッドをAFMスキャナーステージに取り付けます。
これを最低10分間乾燥させます。その間、大きなマイカシートからパンチを打って、直径1.5ミリメートルの厚さのマイカを0.1ミリメートルの厚さの円形にします。高速AFMマイカガラスロッド接着剤を使用して、このマイカピースを高速AFMのガラス棒に取り付け、乾燥しながら最低10分間手つかずのままにします。
次いで、よく切断された層がテープに見えるまで、感圧テープを使用してマイカから層を切断する。次に、蒸留した脱イオン水99マイクロリットルで50ミリモルAPSストックの1マイクロリットルを希釈し、500マイクロモルAPS溶液を作ります。2.5マイクロリットルの溶液を切断したばかりのマイカ表面に沈着し、表面を30分間機能させます。
インキュベーションに続いて、3マイクロリットルのリンスを塗布して蒸留脱イオン水でマイカを数回リンスします。マイカの端に不織布ワイプを置くことによって、各すすいに続いて完全に水を取り除きます。最後のすすめの後、3マイクロリットルの蒸留脱イオン水を表面に置き、少なくとも5分間座らせて非特異的に結合したAPSを取り除きます。
次に、プローブを高速AFMホルダーに入れ、先端を上に向けてAFMステージにホルダーを置きます。100マイクロリットルの蒸留脱イオン水を使用してホルダーをリンスし、続いて0.22ミクロンの2つの100マイクロリットルリンスを濾過したヌクレオソームイメージングバッファーを使用します。リンスを行い、100マイクロリットルの核組イメージングバッファーでチャンバを充填し、先端を水没させる。
レーザーに当たるまで片持ち面の位置を調整します。次に、APSマイカを濾過されたヌクレオソームイメージングバッファで5回リンスし、1リンスあたり4マイクロリットルを使用する。ヌクレオソームアセンブリストックの1マイクロリットルを250マイクロリットルの濾過されたヌクレオソームイメージングバッファに希釈し、最終的なヌクレオソーム濃度の1ナノモルを生成します。
表面にこの希釈の2.5マイクロリットルを堆積させ、それを2分間座らせます。4マイクロリットルの核組み合いイメージングバッファーで表面を2回リンスして、過密状態にならないようにします。最後のすまき後、表面をイメージングバッファで覆ったままにしておきます。
サンプルが下向きになるように、スキャナーとサンプルを先端ホルダーの上に置きます。アプローチを開始するには、設定点振幅を自由発振振幅に近づけて自動アプローチ関数を使用します。サーフェスが適切に追跡されるまで、セットポイントを調整します。
次に、画像領域を150×150ナノメートル前後の200×200ナノメートルに設定し、画像フレームあたり約300ミリ秒のデータ取得率を設定します。アセンブリおよび堆積のための制御として、H3単核体を、静的AFMを用いて調製し、画像化した。この画像は、核種が正常に組み立てられたことを確認する堆積の前に存在していたヌクレオソーム集団のスナップショットを提供します。
H3制御アセンブリが成功すると、提示された方法は次にCENP-Aヌクレオソームの研究に適用された。このサンプルの静的 AFM イメージングは、そのアセンブリが成功したことを明らかにしました。静的AFM画像から、単核球体の高さと回転数を特徴付けることができる。
遊離DNAアームと遊離DNAアームの長さの間の角度の両方が、個々のヌクレオソームにおけるDNAターンの数を決定するために使用される。対照的に、ヌクレオソームの時間経過AFMイメージングは、ヌクレオソームの全体的な自発的なアンラッピング挙動を可視化するために使用することができる。ヌクレオソームのターン数が減少するにつれて、核コア体積の対応する減少も観察される。
通常のタイムラプスイメージングに加えて、高速タイムラプスAFMは、標準のタイムラプスイメージングを使用して見逃されているより複雑なヌクレオソームダイナミクスをプローブするために使用することができます。この技術が長時間にわたってダイナミクスを捉える能力は、1200フレームにわたって捕捉されたCENP-Aヌクレオソームコアの長距離転位の視覚化に不可欠であった。この技術は、あるDNA基質から別のDNA基質へのCENP-Aヌクレオソームコアの稀な伝達を捕捉する上でも重要であった。
高速な画像キャプチャレートにより、この動的イベントの視覚化は、完了するまでに数フレームしかかからなかったため、可能になりました。広いクロマチン分野では、ライガーヒストンの役割とクロマチンダイナミクスのヒストン倍率に関する重要な質問のセットがあります。これらの質問はすべて、当社のテクニックを使用して答えることができます。
