自動化されたMeshAndCollectプロトコルは、シリアル結晶学と標準的な回転データ収集を組み合わせて、パックサンプルから小さな結晶を測定するために開発されました。このメソッドは、まず同じサンプルホルダに取り付けられた結晶の位置を特定し、その後マージされ、構造の解に使用される部分データセットの収集を指示します。MeshAndCollectは、あなたが迅速かつ同じセットアップ、構造溶液、配位子スクリーニング、および小さな結晶でそれらのすべてで実験を行うことができますので、説得力があります。
この方法は、高い光子フレックス、小さなビーム直径、高速リロード検出器を備えたシンクロトロンビームラインのVMXと互換性があります。まず、タンパク質結晶学ビームラインのデータベースの拡張情報システムに接続し、実験番号とパスワードを使用してAフォームからMX.Logを選択します。次に、[出荷追加新規] を選択し、要求された情報を入力します。
[部分を追加]を選択し、関連するデータを入力します。[コンテナーの追加] を選択し、SC3 パックを選択し、パック内のサンプル ホルダの位置を含む必要な情報を入力します。実験小屋で、パックをサンプルチェンジャードーアにロードし、その位置をメモします。
次に、タンパク質結晶性ビームラインのデータベースの情報システムにログインします。[実験の準備]を選択し、[出荷]を見つけて[次へ]を選択し、サンプルチェンジャのビームラインとパック位置を指定します。Aフォームに記載されている実験番号とパスワードを使用して、ビームライン制御ソフトウェアにログインします。
Sync を押して、ビームライン制御ソフトウェアをタンパク質結晶化ビームラインのデータベースの情報システムと同期させます。ビームライン制御ソフトウェアを使用して、サンプルホルダーをゴニオメータに取り付けます。次に、サンプルチェンジャ領域の位置を右クリックし、[サンプルのマウント]を選択します。
中央ボタンを選択し、3 回クリックすると、ループの先端の端の中央に中央に移動します。[保存]を選択して、中央の位置を保存します。[詳細設定] で、ワークフロー [ビジュアルの方向変更] をデータ コレクション キューに追加します。
次に、[キューの収集] をクリックしてワークフローを起動します。次に、保存した中心位置の 1 つをクリックして選択します。中央ボタンをもう一度クリックし、ループのステムの始点の中央に3クリックの中心をクリックします。
[保存] をクリックして、2 番目の位置を保存します。次に、[続行] をクリックします。ワークフローがサンプルホルダの平面をゴニオメータの回転軸に合わせ、メッシュの中央のどこかにサンプルホルダを再び中央に配置します。
ビームライン制御ソフトウェアを使用してオメガ軸を回転させることにより、メッシュの面がX線ビーム方向に垂直になるようにサンプルホルダーの方向を設定します。ビームラインコントロールソフトウェアで、Aperture ドロップダウンメニューをクリックし、値を選択します。メッシュ ツール アイコンをクリックして、メッシュ ツール ウィンドウを表示します。
ビームライン制御ソフトウェアのサンプルビューで、左クリックしてマウスをサンプルホルダーの結晶を含む領域の上にドラッグしてメッシュを描画します。メッシュを保存するには、メッシュ ツール ウィンドウのプラス ボタンをクリックします。ビームライン制御ソフトウェアの解像度フィールドに、回折画像を収集する解像度を入力します。
結晶の回折品質に関する事前の情報が不明な場合は、2 と 2.5 の間の値をお勧めします。[高度なデータ収集]タブで[メッシュアンドコレクト]を選択します。キューに追加し、[キューの収集] をクリックします。
パラメータ ウィンドウで、梁線依存の既定パラメータを使用します。ここで説明する実験では、既定のパラメータは、メッシュ スキャン ポイントあたり 0.037 秒の露出時間、100%伝送、およびメッシュ スキャン ラインあたり 1 度の振動です。[続行] をクリックします。
メッシュスキャンが実行され、各グリッドポイントで収集された回折画像が解析され、ソフトウェアDozerで回折強度に従ってランク付けされます。Dozer 解析の後、ヒート マップが生成され、その後の部分データ収集の順序が回折強度に基づいて自動的に割り当てられます。最後に、[続行] をクリックして、部分的なデータ コレクションを起動します。
MXCuBEに実装されたMeshAndCollectは、結晶の視覚的同定が困難であった同じサンプルホルダー上にあるセルリアンの小さな結晶からの部分的な回折データセットの収集に使用されました。サンプルホルダをスクリーニングするために、グリッドをメッシュループの中心に描き、Dozerスコアヒートマップに基づいて、85個の部分回折データセットを自動的に収集しました。これらは個別に統合され、1.7オングストロームの解像度で99.8%の完全性を持つデータセットを生成するために統合されました。
予想通り、セルリアンの結晶構造は、生成されたデータセットを用いた分子置換によって解明できた。改良後、R作品22.8%、Rフリー25.4%を得た。以前に決定された構造のスーパーポジションは、0.1オングストロームのc-α位置にグローバルRMSDを示す。
結晶成長段階の最適化を行うプロジェクトでは、MeshAndCollectは、より小さい結晶から得られたこれらのアモルファス部分データセットの組み合わせに基づいて完全なデータセットを取得する可能性を提供します。この技術は、構造生物学者が、わずか数十分のマイクロ結晶しか生成できない部品サンプルから構造を解く道を開いた。
