単粒子クライオEM分析は、膜タンパク質、アミロイド線維、核酸結合タンパク質およびウイルスを含む幅広い標本に適用される構造生物学者のツールボックスにおける日常的な技術となっています。サンプルの準備が完了し、グリッドが顕微鏡にロードされると、データ収集は、アストベリーバイオストラクチャー研究所やeBICなどの多くのクライオEM施設で遠隔で行うことができます。構造決定を成功させるための主な障壁は、多くの場合、このプロセスを通じて必要な複数の反復を伴うサンプル調製およびグリッドスクリーニング段階にあります。
ここでは、リモートグリッドスクリーニングと単粒子データ取得について説明します。顕微鏡のユーザーインターフェイスの自動ローダータブで、矢印を使用してオプションダイアログをタブアウトし、インベントリボタンを押します。これにより、カセット内の各位置を順次チェックして、カートリッジが存在するかどうかを確認します。
インベントリは各スロットで順番に実行されます。すべての占有スロットがマップされると、インベントリは停止します。顕微鏡列に転送するグリッドをハイライトし、荷重をクリックします。
グリッドがステージに正常にロードされると、スロットラベルは青から黄色に変わります。グリッドをスクリーニングするには、EPUソフトウェアを開きます。準備ページで、取得用光学と設定を選択し、ドロップダウンメニューからアトラスプリセットを選択します。
適切なビーム設定プリセットを選択し、パラメータを顕微鏡に押し込むプレスセットを選択します。を押してカラムバルブを開き、インフルエンザの画面を挿入します。ビームが見え、検出器を覆うために十分に広がり、中央に配置されていることを確認します。
必要に応じて、ジョイスティックまたは仮想ハンドパネルを使用してグリッドのより薄い領域にナビゲートし、XとY.のステージの動きを制御します。EPU で、アトラスページに移動し、新しいセッションを押します。MRC 画像形式を選択し、スクリーニングセッションを保存するための適切なフォルダ名と場所を入力し、[適用]をクリックします。
左側のメニューからスクリーニングを選択します。各グリッドの横にあるチェックボックスをオンにして、アトラスモンタージュを取得し、EPUでスクリーニングセッションを開始します。アトラスはチェックされたグリッドごとに取得され、使用可能なグリッドの正方形は完了時にリストされます。
各アトラスは、スクリーニングページでハイライト表示することで表示できます。完了したら、収集したアトラスを確認し、より高い倍率でサンプル品質を評価するのに適したグリッドを特定します。EPU スクリーニングメニューで選択したグリッドをハイライト表示し、サンプルの読み込みをクリックします。
アトラススクリーニングメニューから、現在ロードされているグリッドを選択し、グリッド画像上の目的の位置を右クリックして、ここで移動ステージを選択することで、塗りつぶされた穴を含むグリッドの正方形にステージを移動します。EPU準備ページに戻り、グリッドの正方形のプリセットを選択します。EPU 自動機能ページを開き、グリッドの正方形のプリセットでステージ傾斜によって自動ユーセントリックを実行して、サンプルをユーセントリック高さに移動します。
EPU の準備では、新しいグリッド正方形のプレビューイメージを取ります。異なる穴の間のグレーの値は、異なる氷の厚さを示しています。右クリックしてステージを移動し、ここでステージを移動して、穴の上にステージを移動します。
穴またはユーセント高プリセットを選択し、[プレビュー]をクリックします。データ取得プリセットを選択し、パーティクルを容易に識別できる倍率を設定します。デフォーカスオフセットを負の3~5マイクロメートルに設定します。
グリッド全体の粒子分布、配向、汚染の氷の厚さの範囲を再評価するステップを反復処理します。顕微鏡の可用性に応じて、データ収集に直接継続するか、または他のサイトを含む将来の収集のために顕微鏡からグリッドを取り除くことができます。アトラスを設定し、アトラスを取得するグリッドを選択して、スクリーニングから利用できない場合は、アトラスを収集します。
アトラスを取得し、出力を表示するには、グリッドの場所をクリックします。アトラスが完成したら、プロジェクトの実験ニーズに従って、ビーム設定のプリセットをそれぞれ定義します。イメージシフトキャリブレーションを実行します。
EPU ページ・セッションのセットアップを選択し、新規セッションまたは新規セッションのいずれかを選択して、EPU セッションをセットアップします。新しいセッションを選択すると、以前の設定を使用するオプションを提供するポップアップが表示されます。設定は、前の EPU セッションから自動的にロードされます。
または、環境設定から新しいを選択し、保存された環境設定を持つファイルを選択して、この情報を現在のEPUにプリロードします。セッション名に有益な情報を入力します。タイプで、手動を選択します。
取得モードでは、収差フリー画像シフトコレクションが利用可能で希望される場合は、正確な穴中心または高速取得を選択します。目的の画像形式を選択し、ストレージフォルダを選択すると、EPUはセッション名のディレクトリを作成します。使用しているグリッド穴の間隔に応じて適切なグリッドを選択し、[適用]を押します。
初期グリッドの正方形を選択し、取得テンプレートを設定します。正方形の選択に移動します。すべての正方形が緑色の場合は、左上の[すべて選択解除]をクリックします。
タイルを開くには、右クリックして [開く] タイルを選択します。[選択] をクリックし、右クリックして [ステージをグリッドの正方形に移動] を選択して、グリッドの正方形を追加または選択します。穴選択に移動し、自動ユーセントリックを押します。
グリッドの正方形のイメージが撮影されるまで待ちます。オートファンクションが失敗した場合は、高さが大幅にオフになっている可能性があります。それはグリッドの正方形の倍率でインフルエンザスクリーンを使用して手動で調節することができる。
穴のサイズを測定するには、正しいサイズと間隔で穴の上に黄色い円を移動して調整します。穴を探して押します。穴が正しく見つかったことを確認します。
ない場合は、穴のサイズを変更し、もう一度穴を探します。このプロセスが一貫して失敗する場合は、グリッドの正方形の倍率で、より小さい数または明るいスポットサイズに移動することを検討してください。右側のフィルター氷品質ヒストグラムを使用して、穴の選択を調整します。
これは、厚い氷と薄い氷のある領域を除外するのに役立ちます。これは、セッション中に選択された将来のグリッドの正方形のために記憶されます。上部の選択メニューのツールを使用して穴の選択を最適化します。
たとえば、グリッド バーの近くにある穴を削除をクリックします。テンプレート定義に移動し、取得を押します。[検索]をクリックし、穴を中心にします。
ステージシフト後の遅延と画像シフト後の遅延時間を1~5秒に変更し、可能であれば最大画像シフト値を確認します。[取得領域を追加]をクリックし、画像上の任意の場所をクリックします。取得エリアを目的の場所に移動します。
右上に焦点を合わせ解除する範囲を追加します。膜タンパク質プロジェクトの典型的な焦点外リストは、負の0.8〜負の3マイクロメートルの焦点外であり、その後、他の獲得領域を追加し、取得領域がビームで二重に露出しないように配置する。[オートフォーカス領域を追加]をクリックし、画像上の任意の場所をクリックします。
オートフォーカス領域を穴の周囲のカーボンに移動します。標準的な方法は、AFIS を使用する場合は中心を置いた後、または正方形全体の Z 高さ変動に応じて 5 ~ 15 マイクロメートルごとに焦点を合わせる方法です。[ドリフト測定領域を追加]をクリックします。
ドリフト測定は、標準設定として1秒あたり0.05ナノメートルの設定されたしきい値で、グリッド四角形ごとに1回実行されます。ドリフト測定領域は、オートフォーカス領域と直接重なることができます。ドリフトとオートフォーカスエリアが取得エリアと重ならないようにします。
正方形の選択に戻り、グリッド上で取得する正方形を選択します。取得エリア数とデータ取得率を使用して、必要な取得エリアの数を予測します。必要な四角形をすべて選択したら、[すべての正方形を準備]を押します。
各正方形が収集されたら、グリッドの正方形間を移動し、選択ブラシを使用して穴を微調整します。標本の上のステージの位置に移動し、ユーセントリックな高さを設定するために自動機能を使用します。前述の顕微鏡ソフトウェアを使用して、およびテキストで顕微鏡のアライメントを行います。
EPUで目的の絞りを挿入し、中央に配置し、対物レンズの乱視を修正する前に、オートファンクション内でコマフリーアライメントを行います。両方のアライメントが適切な値に収束していることを確認します。自動取得を開始する前に、オートローダーターボポンプの電源がオフで、必要に応じて目的の絞りを挿入してください。
自動取得では、実行を開始して自動データ取得を開始します。このプロトコルを使用すると、破損または乾燥したグリッドをアトラスステージでスクリーニングおよび廃棄することができます。氷の勾配は、グリッドの大部分にわたって観察されます。
スクリーニング中、理想的な粒子分布は、可視の粒子配向の範囲で単分散されます。氷が薄すぎると、電子線で照らされると溶け、顕微鏡写真で過度の動きを引き起こす可能性があります。これは、バッファー内に洗剤がある場合に最も一般的に観察されます。
氷は、画像の大部分が結晶性の氷を示すグリッドの領域が除外されるように、氷をガラス膜にする必要があります。データのグラフィカルな要約は、マイクログラフの品質を評価し、データ収集の修正が必要かどうかを判断するために含まれていました。crYOLOなどのパーティクルピッカーは、データの最初のパスに十分にうまく機能し、2Dクラスの平均化を可能にします。
ジャンク粒子を破棄する必要がある間、二次構造の詳細を示すクラスは、3D解析のために選択する必要があります。パーティクルのサブセットを使用して、3D 分類と細分化の初期モデルを生成できます。RagABの場合、データセットには3D分類中に分離できる3つの異なる適合者が含まれていました。
データ取得とその後の画像解析のステップでの成功は、スクリーニング段階で適切に最適化されたグリッドの取得と識別に依存していることを覚えておくことが重要です。3D EM密度マップが取得されると、タンパク質モデルの適合と精製、または原子モデルデノボの構築によって、さらに解釈することができます。Cryo-EM単粒子解析は、これまで不可能であった多くのターゲットの構造化された決定を可能にします。
特に、これらのワークフローは最近、COVID-19関連の高分子の構造を解くために使用されています。
