この方法は、リンパ内皮細胞(LEC)が特定の刺激にどのように反応し、それが病気の病因にどのように寄与するかなど、リンパ管および肝臓分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、肝リンパ球内皮細胞表現型および機能を細胞ごとに評価することができ、細胞の選別後のダウンストリーム用途に使用できることです。この方法は、肝臓リンパ生物学への洞察を提供することができますが、皮膚や乳腺などの異なる組織からのリンパ性内皮細胞を評価するためにも使用できます。
この手順を実証するには、私の研究室の専門研究アシスタントであるジェフリー・フィンロンです。単離した肝細胞からの単細胞懸濁液を調製するには、マウスに70%エタノールを吹き付け、足を解剖板に固定することから始めます。解剖はさみを使用して、アヌスの上約1センチメートルの皮膚を切断し、歯付き鉗子を使用して皮膚を体から離します。
皮膚と腹骨の間にはさみの先端を挿入し、首まで皮膚切開を続ける前に、組織を分離するためにはさみを開きます。各前肢の下と各後肢の上の解剖板に皮膚を固定し、腹膜袋を上方に引っ張って首に向かって切開を伸ばします。肝臓の葉をつかみ、胸骨のすぐ下を切って肝臓の周りの解剖を可能にする。
その後、クリックのEHAA培地の4ミリリットルに臓器を転送します.メスを使用して肝臓を直径約1ミリメートルに切り、作りたての消化液500マイクロリットルとDNase1の500マイクロリットルで断片を消化します。摂氏37度で15分後、500ミリリットルのピペットを使用して組織を完全に混合し、容器をさらに15分間保育器に戻します。
インキュベーションの最後に、消化したサンプルを100ミクロンのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐形チューブに移し、1ミリリットルのシリンジからプランジャーを使用して、残りの組織部分をメッシュにそっと押し込みます。5ミリリットルの分離バッファーでフィルターを洗い、残りの組織をストレーナーにそっと押します。遠心分離によって単離された肝細胞を収集し、赤血球のリシスバッファーの4ミリリットルにペレットを再中断.
室温で5分後、細胞を10ミリリットルの分離緩衝液で洗い、ヘモサイトメーター上の細胞を数えて完全な肝臓数を決定する。ペレットを20%のイオジキサノールの5ミリリットルで再懸濁し、細胞懸濁液を1ミリリットルのPBSで重ね合わせる。密度勾配分離により細胞を分離し、PBSとイオジキサノールの間の層を収穫する。
その後、100マイクロメートルのストレーナーを通して細胞を新しい50ミリリットル円錐形チューブにフィルターします。新鮮な分離バッファーの 10 ミリリットルで細胞を洗浄し、得られたペレットを PBS の 500 マイクロリットルで再中断, 2% 牛血清、または FBS を補った.カウント後、アリコートアリコートは、遠心分離のための96ウェルプレートの各対照および実験井戸に約10〜6番目の非パレンチマル細胞を、PBSと1ウェルあたりFBSの90マイクロリットルでペレットを再中断する。
適切な実験および対照一次抗体カクテルを各ウェルに加え、適切な生存マーカーですべてのウェルを染色します。この手順で最も重要なステップは、抗体の適切な滴定と、染色を検証するための氷型コントロールおよび蛍光-1コントロールの使用です。摂氏4度で30分後、遠心分離機は1ウェルあたり100マイクロリットルのPBSとFBSで細胞を洗浄し、各ウェルから個々の5ミリリットルの丸底フローサイトメトリーチューブに細胞を移し、PBSとFBS/チューブ当たり400マイクロリットルの最終体積に変換します。
次に、少量のセルを使用して、フローサイトメーターのレーザーと補償の設定を調整し、各チューブのすべてのイベントを読み取ります。すべてのチューブが読み取られたら、適切なフローサイトメトリー解析プログラムにデータをインポートします。負の発現が生きていると見なされる生存マーカー色素に基づいて生細胞上のゲート。
細胞のサイズと粒度、および生存マーカー染色発現に基づいて生細胞にゲートし、続いて適切なアイソタイプ制御および蛍光-1データを使用してCD45陰性CD31陽性細胞集団にゲートを付け、正および負の集団を決定する。その後、CD16/32およびポドプラニン発現に従ってCD45陰性CD31陽性細胞をゲートし、CD45陰性CD31陽性、CD16/32陰性ポドプラニン陽性リンパ管内皮、CD45陰性CD31陽性、CD16/32陽性ポドプラニン陰性肝内皮細胞の同定を可能にする。強調内皮細胞はリンパ管および内皮ヒアルロン1を発現するが、CD146は発現しない。
肝単離されたCD31陽性CD16/32陽性細胞は、実証されたようにCD146陽性およびポドプラニン陽性であり、CD31陽性CD16/32陰性細胞は主にCD146陰性であり、ポドプラニン陽性または陰性である。陽性は、蛍光-1染色に基づいて決定した。肝臓リンパ球内皮細胞はCD146陰性およびPDPN陽性である。
血管内皮もマウス肝臓マクロファージもポドプラニンを発現しない。ポドプラニン染色は、胆管の明確な核構造に基づくリンパ管からコリンジクサイトを区別するだけでなく、サイトケラチン7染色によっても使用することができる。リンパ管内皮細胞のみが肝臓で血管内皮成長因子受容体3とプロスペロホメオボックスタンパク質1を同時発現するように、これらのマーカーは、さらに、並べ替えられた肝臓リンパ管内皮細胞集団の純度を確認するために使用することができる。
この手順を試みる間、迅速に作業し、氷の上に細胞を保つことを忘れないでください。この手順に従って、LEC 集団のフローソートのような他の方法は、LECの転写プロファイリングのような追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、肝臓固有のリンパ生物学の分野の研究者が、リンパ球がマウスとヒトの肝臓病にどのような影響を与えるかを探求する道を開いた。
一般的に、この方法に新しい個人は、リンパ内皮細胞が肝臓でまれに、徐々に集団であり、方法を迅速に実行する必要があるため、苦労します。
