Bu yöntem lenfatik ve karaciğer alanlarında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, lenfatik endotel hücreleri gibi, veya LECs, belirli uyaranlara yanıt ve nasıl hastalık patogenezi katkıda bulunur. Bu tekniğin en büyük avantajı, karaciğer lenfatik endotel hücre fenotipve fonksiyonunu hücre bazında değerlendirebiliyor olmamız ve hücre ayrıştırma sonrası aşağı akım uygulamaları için kullanılabilmemizdir. Bu yöntem karaciğer lenfatik biyoloji içgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda farklı dokulardan lenfatik endotel hücrelerini değerlendirmek için kullanılabilir, deri ve meme bezi gibi.
Prosedürü gösteren Jeffrey Finlon, laboratuvarımdan profesyonel araştırma görevlisi olacak. İzole karaciğer hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için, yetmiş yüzde etanol ile fare aşağı püskürtme ile başlar, ve bir diseksiyon panosuna pençeleri güvence altına. Anüs üzerinde yaklaşık bir santimetre deri kesmek için diseksiyon makas kullanın ve vücuttan uzak deri kaldırmak için dişli forseps kullanın.
Deri ve periton arasına makas uçları yerleştirin ve boynuna kadar deri kesi devam etmeden önce dokuları ayırmak için makas açın. Her forelimb altında ve her arka bacak üzerinde diseksiyonu tahtaya cilt güvenli ve boynuna doğru kesi uzatmak için yukarı periton çuval çekin. Karaciğer lobları kavramak ve karaciğer etrafında diseksiyon sağlamak için göğüs hemen altında kesti.
Sonra Click's EHAA orta dört mililitre içine organ aktarın. Yaklaşık bir milimetre çapında parçalar halinde karaciğer kesmek ve taze hazırlanmış sindirim çözeltisi ve DNase 1 beş yüz mikrolitre beş yüz mikrolitre parçaları sindirmek için neşter kullanın. Otuz yedi santigrat derece on beş dakika sonra, iyice dokuları karıştırmak ve başka bir on beş dakika için kuvöz konteyner dönmek için beş yüz mililitrelik pipet kullanın.
Kuluçka sonunda, sindirilmiş örneği yüz mikron süzgeçten elli mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve bir mililitrelik şırıngadan gelen pistonu kullanarak kalan doku parçalarını kafesten hafifçe bastırın. Filtreyi beş mililitre izolasyon tamponuyla yıkayın ve kalan dokuları süzgeçten hafifçe bastırın. Santrifüj ile izole karaciğer hücrelerini toplamak ve kırmızı kan hücresi lisis tampon dört mililitre pelet yeniden askıya alın.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra, izolasyon tampon on mililitre hücreleri yıkayın ve tam karaciğer sayısını belirlemek için hemositometre hücreleri saymak. Peleti yüzde yirmi iyodixanol'ün beş mililitresinde yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu bir mililitre PBS ile kaplama. Yoğunluk gradyan ayırma ile hücreleri ayırın ve PBS ve iodixanol arasındaki katmanı hasat.
Sonra hücreleri yüz mikrometresüzsüzden yeni bir elli mililitrelik konik tüpe süzün. Hücreleri on mililitre taze izolasyon tamponuyla yıkayın ve elde edilen peleti %2'lik fetal büyükbaş serum veya FBS ile tamamlanan 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Sayma sonra, aliquot yaklaşık beş kez on altıncı non-parakimal hücreler her kontrol ve santrifüj için doksan altı iyi plaka deneysel kuyu içine ve pbs artı FBS doksan mikrolitre de pelet askıya iyi.
Her kuyuya uygun deneysel ve kontrol birincil antikor kokteylleri ekleyin ve uygun bir canlılık belirteci ile tüm kuyuları lekeleyin. Bu işlemdeki en önemli adım antikorların doğru titrasyonu ve lekelenmeyi doğrulamak için buz tipi kontrollerin ve floresan-1 kontrollerinin kullanılmasıdır. Dört santigrat derece de otuz dakika sonra, santrifüj iyi başına PBS artı FBS yüz mikrolitre ile hücreleri yıkayın ve her kuyudan tek tek beş mililitre yuvarlak alt akış sitometri tüpleri içine hücreleri transfer PBS artı tüp başına FBS dört yüz mikrolitre son hacmine.
Ardından, akış sitometresindeki lazer ve kompanse ayarlarını ayarlamak ve her tüp için tüm olayları okumak için küçük bir hücre hacmi kullanın. Tüm tüpler okunduğunda, verileri uygun bir akış sitometrisi analiz programına aktarın. Negatif ifadenin canlı olarak kabul edildiği canlı lık işaretçisi boyasını temel alan canlı hücrelerüzerindeki kapı.
Hücrelerin büyüklüğü ve tanecikliliğinin yanı sıra canlılık belirteç boya ekspresyonuna göre canlı hücrelere geçit, olumlu ve negatif popülasyonları belirlemek için uygun izotip kontrolü ve floresan-1 verilerini kullanarak CD45 negatif CD31 pozitif hücre popülasyonuna gating takip edin. Daha sonra CD45 negatif CD31 pozitif hücreleri CD16/32 ve podoplanin ekspresyonuna göre cd45 negatif CD31 pozitif, CD16/32 negatif podoplanin pozitif lenfatik endotel ve CD45 negatif CD31 pozitif, CD16/32 pozitif podoplanin negatif karaciğer sinüzoidal endotelhücre popülasyonlarının tanımlanmasına olanak sağlar. Emfaletik endotel hücreleri lenfatik damar ve endotel hyaluronan bir ifade, ama CD146 değil.
Karaciğer izole CD31 pozitif CD16/32 pozitif hücreler gösterildiği gibi izole de CD146 pozitif ve podoplanin pozitif, CD31 pozitif CD16/32 negatif hücreler öncelikle CD146 negatif ve ya podoplanin pozitif veya negatif iken. Pozitivite floresan-1 boyama dayalı olarak belirlendi. Karaciğer lenfatik endotel hücreleri CD146 negatif ve PDPN pozitiftir.
Ne vasküler endotel ne de murin karaciğer makrofajları podoplanin ifade. Podoplanin boyama da lenfatik damarlardan safra kanallarının farklı nükleer yapıları yanı sıra sitokeratin 7 boyama dayalı kolanjiyositayırt etmek için kullanılabilir. Sadece lenfatik endotel hücreleri co-ifade vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 3 ve Prospero homeobox protein 1 karaciğerde olarak, bu belirteçleri daha da sıralanmış karaciğer lenfatik endotel hücre nüfusunun saflığını doğrulamak için kullanılabilir.
Bu yordamı çalışırken, hızlı bir şekilde çalışmak ve buz üzerinde hücreleri tutmak hatırlamak önemlidir. Bu yordamı takiben, LEC popülasyonlarının akış sıralanması gibi diğer yöntemler, LEC'lerin transkripsiyonel profillemesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, gelişiminden sonra, lenfatiklerin farelerde ve insanlarda karaciğer hastalığını nasıl etkilediğini araştırmak için karaciğere özgü lenfatik biyoloji alanında araştırmacıların önünü açmıştır.
Lenfatik endotel hücreleri karaciğerde seyrek, kademeli bir popülasyon olduğu için genellikle bu yönteme yeni giren bireyler mücadele edecektir ve yöntemin hızlı bir şekilde yapılması gerekmektedir.
