この方法は、DNAナノテクノロジーをリニアオリゴヌクレオチドDASのソース材料からいくつかの円形DASに拡張します。これらの技術の主な利点は、ほとんどのラボでシンプルで堅牢で手頃な価格である点です。円形DNA精製のために、20マイクロリットルのホルムアミドを、新たに調製した、無傷の円形DNAの溶液に、混合して140マイクロリットルの最終体積に加える。
円形DNA溶液を16~20マイクロリットルの円形DNA溶液を7~9個の変性ページゲルウェルそれぞれに積み込みます。2マイクロリットルの負荷染料と8マイクロリットルの対応する前駆体線形DNAを混合し、別の基準ウェルに注入します。次いで、ゲルを10ボルト/センチメートルで約2時間実行し、キシレンシアノールFFがゲルの約3分の2下に観察できるときに実行を停止する。
ゴム手袋とゴーグルを着用し、蛍光薄層クロマトグラフィープレートにゲルを移し、カミソリの刃を使用して、UV照射によって影を落とすようにターゲットゲルバンドを切断します。ゲルバンドを乾燥用の2つのミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、乾燥したゲルをペースト状につぶし、ゲルの2倍の体積で脱イオン化水を加え、室温で一晩振ります。翌朝、混合物を2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにろ過し、残存DNAを回収するために少量の脱イオン水で最初のチューブの側面をすすいで、再び濾過して上華を組み合わせます。
次にエタノール沈殿を介して円形DNAを精製し、マイナス20度で保存します。1つのポットアニーリングの場合、10倍のトリス酢酸EDTAマグネシウムバッファーの2マイクロリットル、10マイクロモルDNAストック溶液の1マイクロリットルを等しいモル比で、追加のTris EDTAバッファーを200マイクロリットルPCR試験管に混合し、最終体積20マイクロリットルにします。その後、48時間以上、95〜25°Cの熱ボトルでアセンブリ溶液をアニーリングします。
無限格子の2段階アニーリングの場合、10倍のトリス酢酸EDTAマグネシウムバッファーの2マイクロリットル、10マイクロモルDNAストック溶液の1マイクロリットルを等モル比で、追加のTris EDTAバッファーを200マイクロリットルPCRチューブに混合し、最終体積20リットルにします。最初のサブタイルアニーリングステップでは、各前駆体サブタイル溶液をPCRサーモサイクラーでアニールし、95~25°Cの高速リニア冷却法を使用して、2時間半以上にわたって冷却します。組み立て溶液を調製するために、4つの無限格子のそれぞれについて、2つの対応するサブタイル溶液のそれぞれ10マイクロリットルを混合し、各ストランドに対して0.25マイクロモルの最終濃度にします。
第2の格子アニール工程において、20マイクロリットルの混合物をPCRサーモサイクラーでアニールし、徐冷法を用いた。2つの有限長方形格子の2段階アニーリングの場合、10倍のトリス酢酸EDTAマグネシウムバッファーの1マイクロリットル、10マイクロモルDNAストック溶液の0.5マイクロリットルを等モル比で、追加のTris EDTAバッファーを200リットルPCR試験チューブに混合します。最初のアニーリングステップでは、PCRサーモサイクラーの各前駆体サブタイル溶液をアニールし、95〜25°Cの高速リニア冷却法を使用して、2時間半にわたって、アニールされた32個のサブタイル溶液を2マイクロリットルずつ混合し、それぞれ200マイクロリットルのPCR試験チューブで、64マイクロリットルの最終体積にします。
次に、第2のアニーリング工程において、サーモサイクラー中の64マイクロリットルの混合物をアニールし、遅冷式法を用いて、実証したとおりである。有限格子の電気泳動精製のために、ネイティブの2%アガロースゲルを調製し、100〜3000塩基対DNAラダーの5マイクロリットルを別のウェルに添加して、各ウェルに有限格子溶液の20マイクロリットルをロードします。氷水浴で5ボルト/センチメートルで2時間ゲルを動かした後、示されているように、UV光の下で1000ベースペアマーカーの約レベルでターゲットゲルバンドを切断し、ゲルバンドを細かい部分にスライスします。
破砕したゲルをフィルター列に入れ、カラムを遠心分離して格子を抽出します。次いで、原子間力顕微鏡イメージング用の溶液を収集する。ポリエタレングリコール(PEG)による有限格子精製のために、有限格子溶液の50マイクロリットルを等量の15%PEG 8000バッファーと混合し、溶液を遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルのPEGバッファーに再懸濁させて、さらなる遠心分離を行う。
第2遠心分離後、原子間力顕微鏡イメージング用にトリス酢酸EDTAマグネシウムバッファー内のペレットを再懸濁する。無限の2D格子原子間力顕微鏡イメージングのために、マイカの新鮮な層を切断し、きれいな表面にアニールサンプルの2マイクロリットルを堆積させます。DNA格子をマイカ表面に吸収させ、表面を2回洗浄する前に、洗浄ごとに100マイクロリットルの脱イオン水で、2回目の洗浄後に圧縮空気で表面を乾燥させる。
空気中の無限DNA格子の原子間力顕微鏡画像を取得するには、画像ソフトウェアでタッピングモードを開き、スキャンサイズを0.5~5マイクロメートル、スキャン解像度を512行、スキャンレートを1~3.5ヘルツに設定します。次に、マイカ表面を三角原子間力顕微鏡プローブでスキャンします。有限DNA格子イメージングの場合、示されているように、マイカの新鮮な層を切断し、きれいなマイカ表面に1倍のトリス酢酸EDTAマグネシウムバッファーの80マイクロリットルを堆積させます。
次に、有限サンプルを5マイクロリットルをバッファーに加え、DNA格子をマイカ表面に吸収させてから、さらに50マイクロリットルのTrisアセテートEDTAマグネシウムバッファーをプローブに追加します。次に、スキャンサイズを0.5~1マイクロメートル、スキャン解像度を256行に、スキャンレートを1.5ヘルツに設定してから、三角プローブで表面をスキャンします。円形DNAは、円形DNA内部の細孔がゲル繊維によって浸透して遅くなるため、変性ページの前駆体線形DNAよりもわずかに遅く移動します。
円形64ヌクレオチド集合ファミリーは、各アセンブリに対して1つの透明でクリーンなバンドを有し、その単量体モチーフの安定性を確認する。しかし、タイルの円形84ヌクレオチドアセンブリファミリーは、主なバンドの周りにスミアを持ち、マイナーな副産物の存在を示しています。●誤った関連付けの製品によるマイナーに関わらず、高収率の優れた格子は対象モノマーモチーフから組み立てることができます。
各アセンブリは、ナノワイヤー、ナノチューブ、ナノスパイラル、ナノリボン、ナノ長方形などのマイクロメートルスケールで独自の形態学的特徴を有する。この手順を試みる間、特にステップ中またはステップ外の破片汚染を避けることを忘れて重要です。開発後、この技術は、DNAナノテクノロジーの分野での研究が、より円形のDNAナノテクノロジーの新しい家族を探求する道を開きました。
