液滴から100万以上のユニフォームが指サイズの基板上に生成されます。そして、単一のDNA分子は、各液滴にランダムに分布しています。タンパク質の収率は、液滴中の分子の数に比例します。
我々の技術は、複雑なタンパク質の発現と精製なしに酵素活性の迅速かつ定量的な測定に使用することができます。まず、カバーグラスを染色ラックにセットし、8つの水酸化ナトリウムモルにラックを置きます。カバーガラスと染色ラックを室温で15分間超音波処理します。
水酸化ナトリウムから染色ラックを取り出し、カバーガラスを水で10回すすいでください。カバーガラスをエアガンで乾かします。その後、ホットプレートのカバーグラスを200°Cで5分間焼いて乾燥させます。
0.05%アミノシラン溶液を調製します。この溶液にカバーガラスを浸し、室温で1時間インキュベートします。カバーグラスを純水で5回すすいでください。
その後、エアガンを使用してカバーガラスを乾燥させます。ホットプレートの上で摂氏80度で5分間焼きます。カバーガラス基板をスピンコーター用のカスタマイズされた真空チャックに置きます。
ガラス基板の中心に70~90マイクロリットルのタイプACYTOPポリマーを塗布する。その後、直ちにポリマーをスピンコートする。初期ポリマーコーティングは、最終的なマイクロチャンバアレイの品質を損ないます。
気泡を導入せずに、ポリマーをカバーガラスの中央に分配します。コートガラスを角に持って取り上げ、アルミホイルの上に置きます。摂氏80度で30分焼き、さらに1時間は摂氏200度で焼きます。
基板の中心に0.2~0.3ミリリットルのフォトレジストを塗布します。直ちにフォトレジストを6,000rpmで60秒間スピンコートします。エタノール浸しのワイプを使用して、余分なフォトレジストを基板の端から取り除きます。
基板を摂氏110度で5分間焼きます。フォトレジストを水分補給するには、基板を42〜60%の相対湿度で30分間放置し、マスクアライナーに基板をロードし、真空接触モードで25秒間露出させます。次いで、基板を現像体に5分間浸漬し、露出したフォトレジストを溶解させる。
純水を用いて基板を10回リンスする。その後、エアガンを使用して基板を十分に乾燥させます。反応性イオンエッチング機の反応室に基材を入れ、光レジストを酸素プラズマで覆ったCYTOPにエッチングします。
エッチング後、残りのフォトレジストを室温で5分間アセトンで超音波処理して除去する。その後、5分間プロパノールに基板を超音波処理します。原稿に記載されているように純水を使用して、再び、すすい、超音波処理、および基質をすすい。
その後、エアガンで基板を乾燥させます。デスクトップカッターを使用して、ダブルコーティングされた接着剤カプトンフィルムテープを定義されたマイクロチャネル形状にカットします。テープのカット部分を平らなペトリ皿の底に貼り付け、PDMSの成形のマスターとして機能します。
テープパターンのペトリ皿にPDMS混合物を注ぎます。その後、ペトリ皿をミニ真空チャンバーに入れ、PDMS混合物を1〜3時間脱気します。その後、ペトリ皿を摂氏60度のオーブンに入れ、PDMSを治すために一晩放置します。
PDMSが硬化した後、ペトリ皿から硬化エラストマーを剥がし、フラットケーブルカッターを使用してPDMSマイクロチャネルブロックを切り取ります。その後、各マイクロチャネルの両端に穴を開けます。以前に準備された基板は、マイクロチャンバアレイ用の領域を有する。
PDMSマイクロチャネルを基板のこの部分に配置します。次に、PDMSマイクロチャネルの穴の1つに200マイクロリットルのピペットチップを挿入します。まず、CFPS反応液をPCRチューブで調製します。
次いで、200マイクロリットルの非フィルターピペットチップを使用して、溶液の10マイクロリットルを引き出す。PDMSマイクロチャネルの入口穴にピペットチップを挿入し、マイクロチャネル出口から溶液があふれるまでパイププランジャを押し下ろします。FemDAデバイスを冷やされたアルミニウムブロックに移します。
マイクロチャンバアレイ領域が半透明から透明にすばやく変わることを確認します。300マイクロリットルの冷蔵フラッシュオイルを引き出し、すぐにマイクロチャネルインレットホールのピペットチップにオイルを移します。フラッシュオイルはマイクロチャネルに移動し、マイクロチャンバの外側にある過剰な反応溶液を押し出します。
同時に、挿入された 2 つのピペットチップをデバイスから取り外します。すぐに装置をアルミブロックからパラフィンフィルムに移動します。PDMSマイクロチャネルの入口にシール油を含む準備されたピペットチップを挿入し、それが出口からあふれるまで油を注入します。
フェムトリットル液滴は、個々のマイクロチャンバーに油によって密封される。焦点が合っていない BF イメージを開きます。すべてのフレームから連続した連続した背景を削除するには、[プロセス] メニューの [背景を減算] を選択します。
ローリングボール半径に20を入力します。[プレビュー] ボックスをオンにして、[問題] を選択します。すべての画像を処理するかどうかを確認する場合は、[はい]を選択します。
次に、ノイズを低減するには、[プロセス]、[フィルタ]、[中央値]の順に選択します。半径をピクセル単位で 2.0 と入力します。[プレビュー] ボックスをオンにして、[問題] を選択します。
すべての画像を処理するかどうかを確認する場合は、[はい]を選択します。次に、[イメージ]、[調整]、[しきい値] を選択して、マイクロチャンバの画像と画像の背景を分離します。「プラグイン」メニューから「FemDA、FemDA 分析」を選択します。
1つのマイクロチャンバーのピクセルのおよその最小および最大の数を入力します。マイクロチャンバの予想される最小および最大の円形度と開始フレーム数と終了フレーム番号を選択し、[ROI を生成]を選択してマイクロチャンバを検出します。正常に検出された ROI は、ポップアップ メニュー ROITable に表示されます。
「FemDA 解析」ウィンドウで、「ROI マスクを適用」を選択します。画像を調べて、マイクロチャンバーが正しく検出されたかどうかを確認します。蛍光画像を開き、前面に持って行きます。
もう一度[ROI マスクを適用]をクリックして、ROI を蛍光画像に追加します。FemDA 解析ウィンドウで、ワンショットを選択して、画像の終点データを解析します。各 ROI の上端ピクセルを使用して、対応する液滴の平均強度を計算する上端ピクセル数に N を入力します。
次に、[強度を測定]をクリックして、検出されたすべての液滴の平均強度を計算します。ROITable は蛍光画像の新しいデータで更新され、ヒストグラムが新しいウィンドウに表示されます。[テキストとして保存] ボタンをクリックしてデータをエクスポートします。
蛍光溶液をFemDAマイクロチャンバーおよび蛍光強度にカプセル化し、これは液滴サイズと相関し、顕微鏡を用いて測定した。液滴は狭いサイズ分布を有することが判明した。共焦点顕微鏡からの再構成された3D画像はまた、時間の経過とともに一貫した液滴サイズを示した。
液滴は、蒸発損失や液滴間の交差汚染を伴わずに室温で少なくとも24時間安定していた。蛍光タンパク質mNeonGreenをフェムダで合成した。スタック画像データは、同時に焦点が合っていない明視野画像の助けを借りて分析した。
各液滴の蛍光強度はタンパク質収率を測定するため、ヒストグラムは1滴当たりのDNA分子の数が等しくなることを強く示唆している。異なる数のDNA分子を含む液滴の確率は、ポアソン分布に完全に適合した。また、5分毎に撮影した画像を用いて、フェムダで酵素アルカリホスファターゼの合成を行った。
反応は、以前の時点での液滴の蛍光強度の同様の慎重な分布を示し、ヒストグラムの結果は、液滴中のDNA分子の不等数であることを確認した。個々の液滴に封入された単一のDNA分子は、さらに回収、増幅、および配列決定することができるので、最高のタンパク質スクリーニングが可能になる。小容量と安定性の高いいずれかの液滴技術は、特定のバイオマーカーを用いたがん疾患の迅速かつ正確な分子診断を可能にする。
