著者は有用な議論や作業のための非常に貴重な議論と助言し、バチェレラボのすべてのメンバーのためのS.ダグラスに感謝したいです。この作品は、生命科学の学部とバー - 宜蘭大学のナノテクノロジー＆アドバンストマテリアル研究所からの助成金によってサポートされています。

ステープルズプール混合物の調製<ol><li> 表1に記載された96ウェルプレート上に凍結乾燥したDNAナノロボットのステープルを注文（材料を参照）、10ナノモルに正規化します。 DNAのナノロボットの設計とアーキテクチャの詳細についてはベン・Ishay ら 14、ダグラスらを参照してください。15）。 </li><li> 100μMの濃度にDNアーゼ/​​ RNaseフリーの超高純度でうまく各ステープルを再構成します。ステープルが10ナノモルに正規化するために、超純水100μlで再構成します。 </li><li>プール一緒にマルチチャンネルピペッターおよび滅菌55ミリリットルソリューション流域を使用して、各ステープルの20μlの。 注：ナノロボットの形状（コア、エッジ、ハンドルおよびガイド配列を含む、 表1）254短 ​​鎖から構成されているので、ステープル・プール内のステープルの各々の濃度は394 nMです。ステープルプールからステープルを削除するか、別の巻でのいくつかを追加しますリューム、かなりの収率を減少させる、またはそれ以外の場合は折り畳まれていない集合体になることがあります。 </li></ol>製作反応混合物の調製<ol><li>標準的な反応混合物について（材料を参照してください 、100 nMの原液）足場DNAの4ピコモルに対応し、M13mp18のウイルスゲノム環状一本鎖DNAを40μlを使用しています。製造混合物中の足場の最終濃度は20 nMで、最終容量200μlのです。 <ol><li>具体的なニーズに応じて足場DNAの量を調整します。しかしながら、一定の20 nmで反応混合物中の骨格DNAの最終濃度を保ちます。 </li></ol></li><li>それぞれ、1〜10のステープル比に足場に到達するためにステープルを加えます。 20nMの足場DNA濃度について、ステープル254 &#39;の最終濃度の各々は、200nmです。 200μlの最終反応容量についてステープルプール混合物（セクション1.2）の102μlを添加します。 <ol><li>目に別々に特定のゲート列を追加します。Eは、この時点で、反応混合物を折り畳みます。これらのオリゴは別途注文し、HPLC精製を必要としています。 20 nMの足場濃度について各オリゴのすなわち 200 nMの、ゲートオリゴ1:10足場ゲートにシーケンス比で存在することを確認してください。 200μlのフォールディング反応容量については、100μMのストック濃度で4門オリゴのそれぞれについて、0.4μlを添加します。 </li></ol></li><li> 1×TAE（40mMのトリス - 酢酸、1mMのEDTA）の最終濃度に到達するために10倍TAEストック緩衝を追加します。 200μlのフォールディング反応容量の場合、10倍TAEの20μlを添加します。 </li><li> 10mMの最終濃度まで、1MのMgCl 2を加えます。 200μlのフォールディング反応容量は、1 MのMgCl 2の2μlを添加します。 </li><li> 200μlの最終容量に到達するためのDNase / RNaseを含まない超純水36μLを加えます。 </li><li> PCRバイアルにボルテックスし、アリコート100μlのサンプル。 注：使用される最大反応体積に関するサーマルサイクラーの仕様を参照してください。これらの制限を満たすために音量を小さくすると得られた収率は減少しません。指定された最大上記の反応ボリュームは利回りを危うくします。 </li></ol>製造反応の3高温アニールのランプ<ol><li>以下のようにプログラムサーマルサイクラー： <ol><li> 5分/℃の割合で60℃まで85℃に上昇します。 </li><li> 75分/℃の割合で4℃まで60℃に上昇します。 </li><li>無期限に4℃で保持します。 </li></ol></li><li>製造後に-20℃で保存するサンプルを終了しました。 </li></ol>過剰ステープルズの4取り外し<ol><li> 100キロダルトンのMWCOと0.5ミリリットル遠心分離フィルターにフォールディング反応混合物の100μLを加えます。後の分析のためにnanorobots予備精製の10μlのサンプルを保存します。 </li><li> 9,600×gで10分間遠心。 </li><li>フォールディングバッファー（1×TAE、10のMgCl 2）400μlのを追加します。 </li><li>繰り返し二回より4.2と4.3を繰り返します。 </li><li>9,600×gで5分間遠心。 </li><li> 9,600×gで1分間きれいなマイクロ遠心チューブやスピンに逆さまにフィルタを配置することによって濃縮物を回復します。最終容積は、フィルタに入れ、製造の反応混合物の初期量に依存して変化し得ます。典型的には、濃縮されたナノロボット試料25-60μlの最終容量を得ました。 </li><li> 260nmで分光光度計を経由して試料中のDNA濃度を測定します。ナノロボットサンプルのモル濃度を算出する際に5.3μgの/ピコモルの分子量を使用してください。 注意：二本鎖DNA、50μgの/ OD 260のためのモル吸光係数を、ほとんどのアプリケーションで十分です。 48μgの/ OD 260は、エッジのステープルの口座に一本鎖DNAが伸びポリチミンを取ります。 </li></ol>二つ折りNanorobotsの5アガロースゲル電気泳動分析<ol><li> 0.5×TBE（45mMのトリス-ホウ酸、1mMのEDTA）を10mMのMgCl 2を補充した2％アガロースゲルの調製</suB&gt;（エルネスト・カストロらから適応21。）： <ol><li> ddH 2 Oの118.75ミリリットルで10倍TBEストック緩衝の6.25ミリリットルを希釈することにより、0.5×TBE緩衝液を準備</li><li> 0.5×TBEバッファーの125ミリリットルで、アガロースの2.5グラムを溶解します。 </li><li>アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで煮。 </li><li> 10mMの最終濃度になるように、1MのMgCl 2の1.25ミリリットルを追加します。 </li><li> 10 mg / mlの臭化エチジウムの7μLを加えます。 </li><li>少しクールを解決するために待って、アガロースゲル固化する前にゲルトレイを埋めます。すぐに目的の櫛をインストールします。 </li><li> ddH 2 Oを 940ミリリットルに10倍のTBEストック緩衝し、1MのMgCl 2の10ミリリットルの50ミリリットルを追加することで、ランニング緩衝液1 Lの0.5倍のTBEを準備</li><li>ゲル電気泳動デバイスにバッファを実行している固体のアドオンで、氷浴中にデバイスを入れたら。 </li></ol></li><li>足場と一緒nanorobots予備精製の負荷1μgの全DNA（ステップ3.2）、および精製後（ステップ4.7）、ゲル上のDNAサンプルと1 kbのDNAマーカー。 例を図2に示す 。試料の実際の体積は、精製後に得られた濃度に依存します。 6、最終体積比：各サンプルは1でローディングバッファーにロードされます。 </li><li> 80 Vに電源​​を設定し、3時間ゲルを実行します。氷と水で満たされた浴中でゲルを実行します。 Nanorobotsは展開し、アガロースゲル電気泳動中に熱くなる場合スメアとして表示されます。電気泳動時の加熱からデバイスを保つために、追加の氷を追加します。 </li><li>紫外線テーブル上のビューゲル（ 図2）。 </li></ol>ウラニルギでナノロボットの6陰性染色<ol><li> 2％のウラニルギストック溶液の調製（カストロらから適応23）： <ol><li> 15ミリリットルチューブにウラニルギ粉末100mgを秤量します。 </li><li> 3分間沸騰のDNase / RNaseを含まない超純水は、脱酸素化物をします。 </li><li>脱酸素したお湯（〜60℃）の5ミリリットルを追加します。（前のステップから）ウラニルギ粉末を含む15mlチューブに。しっかり開閉蓋、10分（渦に締めチューブ）のために厳密にアルミ箔と渦に包みます。溶液は黄色の色で濁って表示されます。 </li><li> 0.2μmシリンジフィルターで濾過してソリューションを提供します。溶液は透明になるはずです。 </li><li>小分けマイクロ遠心チューブに溶液200μl。 </li><li>チューブの底のプールサンプルにテーブルトップ遠心機で5分間最大速度で遠心。 </li></ol></li><li>グリッドとネガティブ染色への試料のローディング： <ol><li> （セクション6.1で調製した）2％ウラニルギ溶液200μlアリコートを解凍。 3分間厳密に0.5 M NaOH溶液と渦の10μLを加えます。テーブルトップ遠心機を用いて5分間、最大速度で遠心。 </li><li>一方、グロー放電グリッド0.2ミリバールと30秒25 mAで部屋の空気を使用して。 </li><li>精製後2 nmのナノロボットサンプルの15μlのを追加（secti4.7の）鉗子で開催されたグリッド（）の上面上に、1分間に吸収させます。ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。 </li><li> （鉗子で開催された）グリッドの上面に（ステップ6.2.1から）2％のウラニルメート10μlのを追加します。 </li><li>すぐにろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用しています。グリッド表面に触れないでください。 </li><li>繰り返しは6.2.4と6.2.5を繰り返します。 </li><li> （鉗子で開催された）グリッドの上面に（ステップ6.2.1から）2％のウラニルメート10μlのを追加します。染色溶液を30秒間吸収しましょう​​。 </li><li>ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。 </li><li>グリッドは、少なくとも30分間完全に乾燥TEMに注入する前に、ろ紙上に直面しよう。 </li></ol></li></ol>

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G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+scalable+preparation+of+pure+and+dense+DNA+origami+solutions.">Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+DNA-origami+nanostructures+by+rate-zonal+centrifugation.">Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).</li><li>Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+3D+DNA-origami+object.">Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、製造、精製、およびDNAナノロボットの視覚化を記載しています。デバイスの六角形の筐体の製造に続いて、ナノロボットの機能が容易に、利用可能な一本鎖ドッキング部位14と水素結合相補性への指定位置を見つけ、ロボットに固有の貨物およびセンシングストランドの簡単な紹介とプログラムされています、15,22。 説明した製造プロトコルは、...

核酸のナノテクノロジーのための用途は驚異的です。ワトソン-クリック塩基対と同様に、カスタムメイドのオリゴ2の大規模合成の容易さと相対的な低コストの扱いやすさは、アプリケーション3およびDNAナノテクノロジーの分野での研究の爆発を生成しました。基本的なビルディングブロックとして不動シーマン接合4,5に基づいて、構造のDNAナノテクノロジーは、任意の形状6-8の建設のための自己組織化基本単位としてのDNAを使用しています。 足場のDNA折り紙9技術の最近の開発は、サブナノメートルの精度で複雑 ​​な2D / 3Dナノアーキテクチャ10-12の構築を可能にし、複雑化し、驚くほどの多様性と新しい機能オブジェクトを構築するための効率的なルートです。建設プロセスが長い足場一本鎖DNAに基づくもので、通常はウイルスGENOM由来短い一本鎖DNAオリゴの何百ものハイブリダイゼーションを介して折り畳むことができるeは、ステープルと呼ばれます。製造の再現性が達成可能な最大の水素結合相補性を容易にするために、短い一本鎖の短配列を調整した結果であるが、この技術により得られた高分解能の構造は、DNA二重らせんの自然な寸法の直接的な結果です。遅い高温アニールの使用は設計最低エネルギーをランプでは、熱力学的に好適なナノ構造は、高い収率及び忠実度に到達しました。コンピュータコードにおける接合設計ルールの簡単な実装は非常に接続された接合部の数百人を含む、大規模で複雑 ​​な構造を設計する作業を簡素化するなどcaDNAno 13などのCADツールの開発を可能にしました。 これまで我々はcaDNAnoツール14,15を用いて、DNAのナノロボットの設計を説明しました。ここでは、製造を表しており、透過型電子顕微鏡（TEM）を介して可視化、の寸法のナノロボット、3D中空六角形のナノデバイス、所定の刺激と存在する特定の貨物に応じて大規模な構造変化を起こすように設計された35×35×50 nmの3、このようなタンパク質や核酸オリゴとして、内部に隔離。 12ロードステーションは、中空シャーシ内部利用可能であるが、バインドされた貨物の実際の数は、貨物のサイズとは異なります。カーゴ分子は、小DNA分子から、酵素、抗体、および5〜10 nmの金ナノ粒子の範囲。どちらCargocan均一または不均一で、各ナノロボットは、異なる分子の混合物を含むようにします。検出はaptasensor 16,17またはDNAの鎖置換技術18のいずれかに基づいて、タンパク質、核酸または他の化学物質を感知するために2つの二重螺旋固定ゲート設計を介して達成されます。アプタマー選択プロトコール19-21における最近の開発は、応答nanorobotsの設計を可能に分子および細胞型の増え続ける範囲。 初期の研究は、その抗原に結合する混合細胞集団15内の特定の細胞型の内側に抑制または多産の信号のいずれかを中継することができる特異抗体を担持ナノロボットを示しました。これらのナノデバイスのエキサイティングな機能は、単一集団内の異なるナノロボットサブタイプの導入で、より複雑なタスクとロジック制御を実行する能力です。最近では、アクティブなカーゴ分子22を含むエフェクター集団を制御する、正または負の調節因子のいずれかとして行うnanorobotsの特定のサブタイプを明らかにしました。 ここで紹介するプロトコルは、ナノロボット15,22の開放を容易にするために、PDGFに選択的に結合するアプタマーセンサー系列でゲートナノロボットの製造、精製およびイメージングを説明します。説明した製造方法は、nと同様です最初に、収率および精製速度を増加させながら、全体的な処理時間を低減することを目的とした変化にダグラスら 15によって示さanorobot製造プロセス。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DNase/RNase free distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13mp18 ssDNA scaffold</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x TAE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15558-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC510024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide 10mg/ml solution&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA marker</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3232S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7021S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uranyl formate</td>
			<td>polysciences</td>
			<td>24762</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbon-coated TEM grids&#160;</td>
			<td>Science services</td>
			<td>EFCF400-Cu-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler c1000 Touch</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow Discharge K100X</td>
			<td>Emitech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV table Gel Doc EZ Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000c</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI-G12</td>
			<td>Tecnai</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

folding and characterization of a bio-responsive robot from dna origami

DNAのナノロボットは、特定の刺激と内部隔離存在貨物に応じて開くように設計された中空の六角形ナノメートル装置です。どちらも刺激と貨物は、特定のニーズに応じて調整することができます。ここでは、DNA折り紙の技術を使用して、DNAナノロボット製作プロトコルを記述します。そして、処理は、折り畳み緩衝液の存在下で長い、円形、一本鎖DNAの足場に添加された原料混合物中に短い一本鎖DNAのステープルを混合することにより開始します。標準的なサーモサイクラーは、徐々にナノロボットの折り後ろ案内力でステープルツー足場アニーリングを容易にするために、混合反応温度を下げるようにプログラムされています。 60時間のフォールディング反応が完了したら、過剰なステープルは、アガロースゲル電気泳動（AGE）を介して可視化に続いて遠心分離フィルターを使用して廃棄されます。最後に、ナノロボットの成功した製造は、透過型電子顕微鏡（TEM）により確認され、ネガティブ染色としてウラニルギを用いました。

代表的な結果を図2Aに示されています。すべてのレーンは、分光光度計（OD 260）を介して測定し、合計1μgのDNAが含まれています。環状一本鎖DNAの足場（レーン2）と比較して、nanorobotsは、それらのより高い分子量、骨格DNA（レーン3赤矢印）にステープルハイブリダイゼーションの結果をゲルに妨げられます。レーン3中の低分子量バンドは、足場のDNA（緑の矢...

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Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami | Chemistry | Video

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

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14.4K ビュー.  Bar-Ilan University. DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM). 

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Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

折り紙インスパイアパターン化され、再構成可能な粒子の自己組織化

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

化学

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic nanostructures. The high spatial precision of a DNA origami-templated assembly allows controlling the coupling between plasmonic resonances of individual particles and enables tailoring optical properties of the constructed nanostructures. Recently, chiral plasmonic systems attracted a lot of attention due to the strong correlation between the spatial configuration of plasmonic assemblies and their optical responses (e.g., circular dichroism [CD]). In this protocol, we describe the whole workflow for the generation of DNA origami-based chiral assemblies of gold nanorods (AuNRs). The protocol includes a detailed description of the design principles and experimental procedures for the fabrication of DNA origami templates, the synthesis of AuNRs, and the assembly of origami-AuNR structures. In addition, the characterization of structures using transmission electron microscopy (TEM) and CD spectroscopy is included. The described protocol is not limited to chiral configurations and can be adapted for the construction of various plasmonic architectures.

We describe the detailed protocol for the DNA origami-based assembly of gold nanorods into chiral plasmonic metamolecules with strong chiroptical responses. The protocol is not limited to chiral configurations and can be easily adapted for the fabrication of various plasmonic architectures.

DNA 折り紙テンプレートを用いたカイラル プラズモニック Metamolecules に金ナノロッドのアセンブリ

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

センシング用途のための無機構造のDNA折り紙媒介基板ナノパターニング

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

プラズモニックDNA折り紙ナノアンテナによる1分子SERS測定

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements Enabled by Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) SERS is able to provide molecule-specific spectroscopic information about individual molecules and therefore yields more detailed chemical information than other SM detection techniques. At the same time, there is the potential to unravel information from SM measurements that remain hidden in Raman measurements of bulk material. This protocol outlines the SM SERS measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) in combination with atomic force microscopy (AFM) and Raman spectroscopy. A DNA origami fork structure and two gold nanoparticles are combined to form the DONAs, with a 1.2-2.0 nm gap between them. This allows an up to 1011-fold SERS signal enhancement, enabling measurements of single molecules. The protocol further demonstrates the placement of a single analyte molecule in a SERS hot spot, the process of AFM imaging, and the subsequent overlaying of Raman imaging to measure an analyte in a single DONA.

著者スポットライト:プラズモニックDNA折り紙ナノアンテナによる単一分子表面増強ラマン散乱測定  

This protocol demonstrates single-molecule surface-enhanced Raman scattering (SERS) measurements using a DNA origami nanoantenna (DONA) combined with colocalized atomic force microscopy (AFM) and Raman measurements.

プラズモニックDNAオリガミナノアンテナによる1分子表面増強ラマン散乱測定

Surface-enhanced Raman scattering (SERS) has the capability to detect single molecules for which high field enhancement is required. Single-molecule (SM) ...