このプロトコルは、EGFP発現大腸菌を用いたマクロファージの貪食能力を評価する簡単で、生産可能な方法を実証した。こんにちは、大連医科大学第二病院のジュンユーといいます。今日、私たちはあなたに簡単に示し、2時間以内に簡単に行うことができるマクロファージ食細胞症を評価する方法を視覚化するつもりです。
この方法は、自然免疫機能の研究で広く使用された。高齢者の自然免疫機能はそのまま残っていると考えられています。そこで今日、私たちは、高齢者と若いマウスから腹膜マクロファージを分離し、これら2つのグループの貪食能力を見るつもりです。
さて、始めましょう。まず、EGFP遺伝子断片を合成し、高忠実度のTaq DNAポリメラーゼを用いてフラグメントをクローン化する。次に、PCR産物をpET SUMOベクターにリゲートします。
第三に、ライゲーション製品を大腸菌株に変換し、乳糖で発現するEGFPを誘導する。これらのEGFP発現大腸菌は、食性細胞化アッセイのマーカーとして役立った。次に、マウス腹腎マクロファージを単離し、培養した。
その後、EGFP発現大腸菌を37センチで1時間マクロファージでコインキュベージした。クエンチステップの後、マクロファージは蛍光顕微鏡とフローサイトメーターの両方による評価の準備が整いました。EGFP遺伝子断片を合成し、高忠実度のTaq DNAポリメラーゼを使用して、前方および逆プライマーで断片を増幅する。
PCR 製品が次のステップで TA クローニング用に単一の 3 エンド アデニン オーバーハングを持っていることを確認するには、最後のサイクルの後に 72 センチグリーで 30 分の延長が推奨されます。アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を確認します。フラグメントが正しく増幅された場合、717 bpバンドがゲル上で観察される。
TAクローニング法をT4 DNAリガーゼで使用してPCR産物をpET SUMOベクターにクローン化します。反応を室温で30分間インキュベートする。5マイクロリットルのPCR産物をBL21コンピテントセルの100マイクロリットルに加えます。
42度のセンチグリーで細胞に90秒間熱ショックを与え、その後、混合物を氷の上に3分間保ちます。LB培地400マイクロリットルを加える, 37センチグリーで予熱.37度のセンチグリーと120rpmで1時間揺れる。
1ミリリットルカナマイシンあたり100マイクログラムでLBプレートの表面に細菌を接種し、ベクター変換された大腸菌をスクリーニングします。37度のセンチグリーオーブンで一晩プレートをインキュベートします。翌日、陽性コロニーを5ミリリットルのLB培地に接種し、1ミリリットルのカナマイシン当たり100マイクログラムを使用する。
37度センチグリーで120rpmでインキュベーターを2時間インキュベートする。次に、インデューサーラクトースを1リットル当たり0.5ミリモルの最終濃度に加え、6時間揺れ続け、EGFP発現を誘発する。経験的に、6時間揺れると、OD600は0.7以上に達する可能性があります。
最後に、蛍光顕微鏡を用いて、EGFP発現の程度を検証した。10マイクロリットルの細菌培養培地をスライドに加える。その後、カバースリップで覆います。
蛍光顕微鏡下でのEGFPの発現を調べる。蒸留水100ミリリットルにチオグリコールレートの3.5グラムを追加します。使用前にオートクレーブで殺菌する。
チオグリコール酸培地をボンネットの1ミリリットルの滅菌注射器に吸引する。感染を避けるために注射器あたり1つのマウス。23ゲージ針を用いてマウス腹腔に3.5%チオグリコール酸ミドの1ミリリットルを注入し、3日間水と食品添加物でマウスを維持します。
3日後、閉じた箱の中でセボフルランによって麻酔を急速に誘発した後、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。その後、無菌に75%エタノールで皿にマウスを入れて、すぐにフードに移します。マウスをプレートに置き、ボードの前足を固定してマウスの位置を固定します。
20ゲージの針を持つ5ミリリットルの注射器を使用して、下腹部の5ミリリットルの冷たいPBSをマウス腹腔に注入し、腸の穿刺を避ける。マウス腹部の両側に優しいマッサージを行います。その後、腹部の液体を穏やかにゆっくりと吸引します。
腹膜液を50ミリリットルの遠心管に分配する。これらの手順を 2~ 3 回繰り返します。4〜8摂氏で400gで10分間、懸濁細胞を遠心分離する。
上清を捨て、10%の胎児ウシ血清でRPMI 1640培地中の細胞ペレットを再懸濁する。フローサイトメトリーアッセイ用の6ウェルプレートの各ウェルに500万個の細胞を加え、1ウェルあたり500,000個の細胞を蛍光顕微鏡用の24ウェルプレートに追加します。一晩5%の二酸化炭素インキュベーターで37度センチグリーで細胞を培養する。
培養培地は、これらのほとんどがリンパ球であったため、非接着細胞を除去するために3時間後にリフレッシュすることができる。明視野顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の生存率と細胞密度を評価します。ここに示す画像は、一次セルの正常な状態であった。
通常、マクロファージ細胞密度は高くなく、腹膜細胞の主要な部分がリンパ球であったためである。24ウェルプレートから培養液を取り出します。100マイクロリットルの新鮮な培養培地と10マイクロリットルの細菌培地を加えます。
その後、5%の二酸化炭素インキュベーターで37度のセンチグリーでプレートを1時間インキュベートします。非内在性細菌を洗い流すために、ウェルあたり500マイクロリットルの冷たいPBSを3〜5回やさしく洗います。室温で4%ホルムアルデヒドを用いて細胞を室温で30分間インキュベートする。
PBSで細胞を3回洗います。F-アクチンを染色するために、ファロイジン633コンジュゲート作業溶液を添加します。暗くて湿度の高い場所に室温で60分間保管してください。
DAPIの働く溶液を加えて、細胞核を染色し、室温の暗い場所で5分間インキュベートします。PBSで1回、蒸留水で同じ体積で1回リンスします。緑色に表示されたEGFP発現大腸菌は、食道細胞症のマーカーとして役立った。
実験エラーを最小限に抑え、結果を適切に解釈するために、表2に示すように実験用のグループと制御チューブをセットします。氷の上に置かれる対照群の場合は、6ウェルプレートから培地を取り出し、PBSで1回洗浄します。その後、細胞を取り外し、フローサイトメトリーチューブに転送するためにウェルに1ミリリットルの冷たいEDTA 1リットルあたり70ミリモルを追加します。
50マイクロリットルの細菌懸濁液をチューブに加え、氷の上に1時間置きます。他のグループについては、培養培地を取り出し、各ウェルに1ミリリットルの新鮮な培地を加える。表2に記載されているグループ設定に従って、50マイクロリットルの細菌懸濁液をウェルに加えます。
その後、6ウェルプレートを37度のセンチグリー5%の二酸化炭素インキュベーターに1時間置きます。非内在性大腸菌の蛍光を消光するには、0.8%の結晶紫色水溶液の200マイクロリットルを井戸に加え、まもなく揺れます。このステップは、マクロファージの表面に結合するEGFP E.coliによる偽陽性結果を避けることを意図したが、内部化されていない。
PBSで細胞を3回洗浄し、残留した結晶を除去します。その後、細胞を取り外し、フローサイトメトリーチューブに転送するためにウェルに1ミリリットルの冷たいEDTA 1リットルあたり70ミリモルを追加します。チューブ2,000rpmを5分間遠心分離し、上清を捨てる。
100マイクロリットルのPBSを加え、細胞を再懸濁する。グループ設定に従って、F4 ATPコンジュゲート抗体を5マイクロリットルチューブまたはアイソタイプに加えます。渦を短時間、暗闇の中で5〜10分間氷上のサンプルをインキュベートします。
各チューブと遠心分離機2,000 rpm 5分間に1ミリリットルPBSを加えます。上清を捨てます。細胞ペレットを200~300マイクロリットルのPBSで再懸濁し、フローサイトメトリー解析を行います。
各チューブを実行し、F4/80陽性細胞の少なくとも10,000個のイベントのデータを取得します。ここでは、若年のグループからの腹膜マクロファージの蛍光画像です。赤色蛍光はF-アクチンを表す。
緑はEGFP発現大腸菌を表し、青色はDAPIによって染色された核を表す。これらの画像は、若いマウスからのマクロファージが老化したマウスのものよりも貪食能力が強いことを示唆している。F4/80陽性およびEGFP陽性細胞は、マクロファージの貪食能力を示した。
これらの結果は、蛍光顕微鏡結果の傾向と一致している。さて、先天性免疫細胞の数は老化したマウスに保存されるかもしれませんが、食細胞能力は若いマウスに比べて有意に低下しました。マクロファージ食道を評価するために多くの方法が採用されている。
ここでは、便利で迅速かつ経済的に実現可能な改善された方法を示します。EGFP発現大腸菌を使用すると、研究者の好みにより、フローサイトメーターと蛍光顕微鏡の両方で食細胞化アッセイを簡単に行い、測定することができます。またこの方法は、貪食能力を直接測定する。
結果は他の間接的な方法よりも再現性が高い。
