このエッセイの全体的な目標は、3次元時間経過顕微鏡による食道細胞の可視化のためのマクロファージおよびオプスン化赤血球を調製することです。この方法は、食細胞が粒子を捕捉し、摂取する方法など、免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、粒子が摂取されたかどうかの評価のみを可能にする従来のエンドポイントアッセイとは異なり、リアルタイムで粒子取り込みを視覚化することを可能にする。
一般に、この方法に慣れ加えた個人は、細胞分離手順に慣れるまで苦労する可能性があります。この共焦点顕微鏡を回して、3D回経過イメージングのファゴサイトーシスを実現する利点を実現したとき、私たちは最初にこの方法のアイデアを得ました。腹膜マクロファージを分離するには、生後3〜4ヶ月のマウスの腹膜に24ゲージのプラスチックカテーテルを入れ、プラスチック製の5ミリリットルの注射器を使用して、1回の洗浄あたりカルシウムとマグネシウムなしで4.5ミリリットルの氷冷HBSSで空洞を2回洗浄します。
吸引した懸濁液を14ミリリットルのポリプロピレン丸底管に移し、回収する。両方のサンプルが収穫されると、遠心分離して吸引し、腹膜細胞を完全な重炭酸塩フリーRPMI 1640培地の1ミリリットルで再懸濁し、ミリリットル濃度当たり60〜6細胞程度を達成する。次に、プレフィルスライドに、フィブロネクチン被覆チャネルスライドの1つの貯留層に完全なHEPES補充培地の1ミリリットルを加え、下流の貯留層から吸引されるようにスライドを傾ける。
不要な気泡を取り除くために、2つの貯水池のいずれかに新鮮な媒体の1〜2ミリリットルを追加し、しっかりと貯水池のキャップを適用します。その後、必要に応じてスライドを傾け、スライドから任意の空気をポンプにキャップにリズミカルな親指の圧力を適用します。すべての空気が排出されたら、スライドを貯留槽を含む上限のない媒体に向かって傾け、空気がチャネルに吸い戻されるのを避けるためにキャップを取り外します。
次に、細胞溶液を数回ピペットして凝集を減らし、二酸化炭素がない場合は37°Cの湿ったチャンバーで2時間インキュベーションするためにスライドの1つのチャネルに100マイクロリットルの細胞を加えます。インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように完全な重炭酸塩補充培地で各スライド内のHEPES含有培地を交換してください。その後、細胞を摂氏37度の湿気の多いインキュベーターに入れ、一晩培養するために5%の二酸化炭素を含めます。
翌朝、得られた新鮮な健康なドナー血液の1ミリリットルを2ミリリットルの丸底ポリプロピレンマイクロ遠心分離管に移す。次にサンプルを遠心分離します。上清を含むプラズマとバフィーコートを取り除く。
そして、慎重に完全なHEPES補充培地の100マイクロリットルを含む2ミリリットルのミルコ遠心分離管に沈積赤血球の100マイクロリットルを移す。チューブ1:1にラベルを付け、希釈した赤血球の4マイクロリットルを、完全なHEPES補充培地の2ミリリットルを含む新しい2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。その後、このチューブ4:2000にラベルを付け、希釈された赤血球サンプルチューブを氷の上に置きます。
腹膜マクロファージにラベルを付けるには、各チャンネルスライドの重炭酸塩培地をHEPESを補充した完全な培地に置き換えます。次にスライドを傾けて、目的の蛍光タグ付きマウスマクロファージ特異的抗体の100マイクロリットルをスライドの100マイクロリットルチャネルの開口部に滴下させて下さ。下流の貯水池に流れ込む培地を吸気し、二酸化炭素が存在しない場合は37°Cの湿ったチャンバーで細胞を20分間インキュベートする。
腹膜細胞は、4:2000赤血球サンプルを穏やかに混合し、新しい2ミリリットルマイクロ遠心チューブに400マイクロリットルを移し、層流フード内の加熱されたアルミニウムブロックで約5〜8分間標識されています。細胞が37°Cに温まったとき、適切な赤蛍光形質膜染色の0.4マイクロリットルを細胞と混合する。次に、セルをヒートブロックに戻します。
5分後、完全な培地と遠心分離機を補充した新鮮なHEPESの1.6ミリリットルを加えることによって細胞を洗浄する。チューブを回転させて、赤血球ペレットを特定します。1~1.5ミリリットルのピペットチップを使用して、ペレットを邪魔することなく2つのボリュームで上清を慎重に除去し、2000マイクロリットルの新鮮なHEPESを細胞と完全な培地を混合します。
遠心分離機を400マイクロリットルの培地中に再懸濁した。次に、プラズマ膜染色のチューブPMSにラベルを付けます。20分間の腹膜細胞標識インキュベーションの終わりに、新鮮な完全なHEPES補充培地の1ミリリットルでスライドを洗浄する。
赤血球をオプゾン化するには、マウスIGG2Bモノクローナル抗ヒトCD235A抗体をPMSサンプルチューブに1マイクロリットル添加する。37°Cで8分後、1分に1回混合して、100マイクロリットルの血漿膜を染色し、ヒト赤血球を腹膜マクロファージにチャネルスライドを含む。ヒトの赤血球が追加されるとすぐに、回転ディスク共焦点顕微鏡にスライドを取り付けます。
ステージインキュベーターを摂氏37度に設定すると、すぐに細胞のイメージングを開始します。ヒト赤血球細胞の赤色蛍光性を呈した緑色蛍光マクロファージのタイムラプス3Dイメージングにより、単粒子食細胞性事象の可視化が可能となる。例えば、マクロファージフィロポジェードによるマウスIGGオプゾン化ヒト赤血球の捕捉が観察できる。
同様に、食細胞性カップ形成中のヒト赤血球の圧迫。このビデオを見た後、マウス常駐腹膜マクロファージ、蛍光標識された細胞、およびオプスニ化粒子を分離する方法をよく理解する必要があります。
