緑膿菌はBSL-2レベルの病原体である。この生物を取り扱うときに、BSL-2レベルの安全慣行に従うことを忘れないでください。ここでは、初代細胞単離、生体内食作用、貪食経路解析、およびマウスにおける生体内食細胞化および細菌クリアランス評価について説明する。
成功した気管内出産は、習得する練習を必要とします。マイクロスプレイヤーが適切にロードされていること、針が2つのボーカルフォールドの間にあり、プランジャー速度が適切に制御されていることを確認してください。まず、ペーパータオルで覆われた解剖板に手足を広げて、マウスを上手にして、前歯の下にひもを引っ掛けて頭を引っ込め、気管がまっすぐで高く配置されるようにします。
70%エタノールでマウスを消毒し、通常の鉗子を使用して身体の中心線で皮膚を引き上げます。外科的はさみを使用して腹部から喉の上まで皮膚を切り取ります。慎重に喉の筋肉や結合組織を解剖するために標準的な外科用ハサミの鈍い端を使用してください。
胸部の下の腹壁を開きます。横隔膜を切り、胸部の下部を切り取って肺を部分的に露出する。スプリングハサミを使用して気管を露出させ、鉗子を使用して軟骨リングをつかみる。
マイクロハサミを使用して、気管の腹側面に約1.5ミリメートルの切開を慎重に行います。気管の下に縫合糸の短い長さを注意深くひもでつなぎ、気管に18ゲージのカニューレを挿入します。カニューレが所定の位置にある場合は、1回の洗浄につき1ミリリットルの新鮮なPBSで肺を3回軽く洗い流し、液を注射器にそっと引き出してから3回連続して肺に再注入します。
各洗浄の後、収集した気管支肺胞洗浄液またはBALFを15ミリリットルの円錐管に移し、全収穫された流体の遠心分離を行う。2回目の遠心分離のために新鮮なPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、洗浄された肺胞マクロファージを10%非熱不活化ウシ胎児血清を補充したダルベックコの修正イーグルス培地またはDMEMの2ミリリットルに再中断します。その後、細胞インキュベーターで摂氏37度で2日間培養するために、一次肺胞マクロファージをガラス底ペトリ皿に移します。
48時間後、培養液を1ミリリットルのPBSで洗浄してから、2ミリリットルの新鮮な培地で培養を供給する。次に、直径50マイクロメートルのカルボキシラスラテックスFITC共役ビーズを培養液に加え、セルインキュベーターで摂氏37度で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、洗浄ごとに新鮮なPBSを1ミリリットルで5回広範囲に洗浄し、細胞外ビーズを取り除き、細胞内ビーズを含む細胞を数える100細胞を無作為に画像化する。
オプゾニンゼーションアッセイの場合、ウサギの抗SRBC免疫グロブリンMまたはIgMの50マイクロリットルを室温で30分間、8番目の羊の赤血球またはSRBCに2回10回インキュベートします。その後、50マイクロリットルのC5欠乏したヒト血清を30分間摂氏37度でインキュベートし、IgMコーティングされたSRBC上のC3bおよびC3b阻害剤補体断片を固定します。次に、培地を吸引し、10マイクロリットルを10回加え、培地1ミリリットル当たり7マイクロソナイズSRBCsを、1回10回含有する96ウェルプレートの各ウェルに10回から4回目の一晩培養マウスマクロファージを1回含む。
SRBCマウスマクロファージの共培養を摂氏37度で1時間インキュベートし、100マイクロリットルの塩化アンモニウムカリウムリシスバッファーで1分間洗浄して、アンバウンドSRBCを取り除きます。非結合SRBCを取り除いた後、100マイクロリットルの媒体ですすいでください。残りの細胞を0.1%のドデシル硫酸ナトリウムでライセし、50マイクロリットルの2、7-ジアミノフルオリン、3%過酸化水素および6モル尿素で補った分解液を処理します。
次に、620ナノメートルの分光光度計でヘモグロビン触媒フルオレンブルー形成の吸光度を測定します。既知の数のSRBCsを持つ620ナノメートルの吸光度値の標準曲線を使用して、貪食化されたオプゾナイズされたSRBCの数を決定します。パターン認識受容体媒介性食細胞症を評価するには、2日間培養したマウス一次肺胞マクロファージを1ミリリットルのPBSで洗浄し、100個のアレクサフルオール-488を結合したZymosan-A-バイオ粒子を含む新鮮な培地500マイクロリットルで細胞を治療する。
摂氏37度で1時間後、500マイクロリットルの氷冷PBSで貪食症を逮捕し、1回の洗浄につき1ミリリットルのPBSで細胞を5回広範囲に洗浄する。最後の洗浄後、4%パラホルムアルデヒドを室温で10分間固定し、実証したように細胞をさらに5回洗浄します。最後の洗浄後、488ナノメートルの差動干渉コントラストと蛍光チャネルでイメージングするための新鮮なPBSの500マイクロリットルで細胞を覆い、Zymosan-A-bioparticle含有肺胞マクロファージの数を定量化します。
in vivo肺胞マクロサイトーシス評価では、麻酔マウスのつまみつまみへの応答が不足し、上部切歯の下にプラスチックワイヤーを付けた平らな板にマウスを置くことによって、適切なレベルの沈液を確認します。腹側表面を上向きにして45度の位置に半リカンベントロストラムにマウスを置き、湾曲した鉗子を使用して舌を引き出して抑制します。次に、声帯の間にマイクロスプレーを挿入して、麻酔下で50マイクロリットルの10マイクロリットルを麻酔動物の肺にP.aeruginosa GFPの6つのコロニー形成単位に投与する。
マイクロ噴霧器の針が気管内にあることを確認するには、注射器をそっと動かし、針の両側の声のひだを観察します。感染の1時間後、ちょうど実証したように洗浄液を採取し、遠心分離によって肺胞マクロファージをペレットする。細胞遠心分離のために新鮮なPBSの100マイクロリットルの3番目の細胞に10回10回再懸濁し、ガラススライドに上に置き直します。
次に、標準的な細胞化学的プロトコルに従って、肺胞マクロファージ、好中球、リンパ球の細胞紡ぎスライドを差し出して染色する。無作為に100の肺胞マクロファージを選び、細菌を貪食した細胞の割合を定量化する。初めての生体内細菌クリアランス試験では、P.aeruginosaのミリリットル当たり約2.5〜5倍の致死量量を麻酔野生型および変異マウスに注入し、毎日6日間各動物の体重を測定する。
2回目の試験では、P.aeruginosaのミリリットル用量当たり7回のコロニー形成単位に致死的な10倍の野生型および変異マウスの新しいセットを注入し、注射後2日以内に死亡を記録し、死亡時または注射後2日後に肺組織全体を採取して、ピーク感染時の肺細菌負担を定量化する。肺を収穫した後、肺サンプルを氷の上の小片に切り、調整された電気ホモジナイザー設定を使用して肺断片を均質化する。その後、10倍の連続希釈液でシュードモナス分離寒天プレートにホモゲネートの100マイクロリットルをプレートします。
蛍光顕微鏡検査では、FITCラテックスビーズのマウス初代肺胞マクロサイトーシスが1時間のインキュベーションの後に発生し、TRIM72ノックアウトマクロファージが著しく高い貪食能力を示すことを明らかにした。逆に、マウスマクロファージ細胞において未知の機能を有するタンパク質TRIM72の過剰発現は、補体食作用の5倍以上の減少をもたらす。しかし、アレクサフルオール-488コンジュゲートZymosan-A粒子は、野生のタイプまたはノックアウトマウスから分離された原発性肺胞マクロファージによって同じ量で摂取される。
野生型およびノックアウト動物から採取されたBALFの差動染色は、同様の数のマクロファージを明らかにするが、ノックアウトマウスから収穫されたマクロファージに対する貪食能力が高い。また、TRIM72ノックアウトマウスは、体重の回復が早く、生存を維持し、気管内P.aeruginosa投与後の野生型動物よりも細菌の負担が低いことを示す。この技術を用いて、好中球食細胞症などの肺炎にとって重要な他の貪食過程および細菌クリアランスにおける他の食細胞の相対的寄与を分析することができる。
薬理学的阻害剤、適応性移動、およびトランスジェニック動物と組み合わせて、この技術は、研究者が関心のある食作用細胞に対する特定のタイプの食作用の分子成分を探求するのに役立ちます。
