ここで提示されたアッセイを用いて、ロタウイルス株間の表現型の差を評価することができ、そこではユニークな株が単離される。具体的には、ロタウイルスの消毒耐性株のフェノチの変化が調べらねない。プラークアッセイを用いた定量的な出力を明確にするため、ロタウイルス株と血清の適切な組み合わせを選択することが重要であり、ロタウイルスは血清に適合している。
この手順を実証するのが、研究室の博士課程の学生、門やSyun-sukeです。液体窒素容器からMA104細胞株を含むCryoTubeを取り除きます。細胞を解凍するために摂氏37度の水浴にCryoTubeを置きます。
T75フラスコ中の血清含有培地の20ミリリットルに細胞懸濁液の1ミリリットルを加える。フラスコを摂氏37度、5%CO2のインキュベーターに2~3日間インキュベーターでインキュベートします。細胞単層が80%合流に達したら、上清を取り除き、1XダルベッコのPBSの5ミリリットルで細胞を2回洗います。
フラスコに0.05%トリプシンEDTAの4ミリリットルを加え、37°Cで5分間インキュベートしてフラスコから細胞を取り外します。細胞懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を190gで5分間移動する。上清を捨て、ペレット化した細胞を1ミリリットルの血清含有培地で再懸濁する。
その後、再懸濁した細胞を培地で100倍に希釈する。薄希釈された細胞懸濁液を、プラークアッセイ用の6ウェルプレートのウェルそれぞれに3ミリリットル加えます。希釈した細胞懸濁液を、細胞結合アッセイ用の24ウェルプレートのウェルごとに1ミリリットル加えます。
プレートを摂氏37度、5%CO2不飽和蒸気で2~3日間インキュベーターにインキュベートします。ウイルス懸濁液1ミリリットルを含むチューブを無血清培地で、マイナス80°Cの貯蔵から37°Cの水浴に移して解凍します。ブタ膵臓からトリプシンのマイクロリットル当たり1マイクログラムをウイルス懸濁液の1ミリリットルに加え、次に渦を加える。
ウイルス懸濁液を摂氏37度、5%CO2不飽和蒸気で30分間インキュベートします。活性化されたウイルス懸濁液を無血清培地で希釈し、感染の多重度(MOI)を細胞当たり0.1 pfuに調整します。希釈したウイルス懸濁液を、細胞めっきの3日後にT75フラスコのMA104細胞に1ミリリットル添加する。
37°Cのウイルスで細胞を1時間、15分ごとに軽く振って培養します。次に、ブタ膵臓からフラスコにトリプシン1ミリリットル当たり4マイクログラムを含む無血清培地30ミリリットルを加える。フラスコを摂氏37度、CO2不飽和蒸気5%でインキュベートします。
感染後0、6、12、18、24、および36時間でフラスコに上澄みの1ミリリットルを収集し、ピペットを使用して1.5ミリリットルのタイプの上清を交換します。マイナス80度で15分以内に凍結融解サイクルを行い、続いて摂氏37度の水浴で15分の融解を行います。その後、チューブを摂氏4度で10分間12、600gで遠心分離します。
上清を集める。蒸留した0.2ミクロンフィルターで上清をフィルターし、細胞分画を除去します。上清をマイナス80度で保存し、ウイルス力計を測定するためのプラークアッセイに適用します。
プラークアッセイを行う準備ができたら、収集した上澄み物を含むチューブを摂氏37度の水浴に入れます。10倍希釈したサンプルの1ミリリットルにトリプシンを加え、37°Cで30分間インキュベートします。この30分間のインキュベーションの間、血清含有培地を取り除いた後、MA104細胞を1X PBSの2ミリリットルで6ウェルプレートで慎重に洗浄します。
インキュベートしたサンプルを無血清培地で連続して希釈し、希釈したサンプルを各ウェルに1ミリリットル接種します。プレートを摂氏37度で90分間、不飽和蒸気5%%でインキュベートし、15分ごとにプレートを軽く振ります。インキュベーション後、6ウェルプレートから接種を取り除きます。
調製した培地にトリプシン1ミリリットル当たり4マイクログラムを加える。穏やかに、しかしすぐに各井戸にアガロースゲルと混合培地の3ミリリットルを追加します。アガロースゲルを室温で10分以上固めます。
その後、37°Cと5%CO2不飽和蒸気で2日間プレートをインキュベートします。次に、1X PBSで希釈した0.015%ニュートラルレッド溶液を1ミリリットルずつ各ウェルに加え、同じ条件でインキュベートします。3時間後に染料を取り出し、1日インキュベートを続けます。
翌日、各ウェルのプラーク数を数え、1ミリリットル当たりのpfuを計算します。プラークアッセイの前に細胞合流を注意深くチェックして、プラーク番号を確認します。細胞結合アッセイの場合、ブタ膵臓からトリプシンのマイクロリットル当たり1マイクログラムをウイルス懸濁液の1ミリリットルに加え、次に渦を加える。
ウイルス懸濁液を無血清培地で希釈し、MOIを細胞あたり1pfuに調整します。MA104細胞を24ウェルプレートに2回洗浄し、トリスバッファー塩分を1ミリリットルずつ使用します。今、希釈されたウイルス懸濁液の100マイクロリットルで細胞を24ウェルプレートの各ウェルに接種する。
15分ごとに穏やかな揺れで90分間、摂氏4度でプレートをインキュベートします。ウイルス接種を除去し、トリス緩衝生理食塩水の1ミリリットルで細胞を2回洗浄する。ロタウイルスの二本鎖RNAを抽出するには、1X PBSの140マイクロリットルと560マイクロリットルのRNA抽出バッファーを各ウェルに加えます。
バッファー内の細胞のヘイズが見えないまでピペットと適切に混合します。二本鎖RNAを回収した後、メーカーのプロトコルに従って、二本鎖RNA抽出物を含む1.5ミリリットルのチューブを摂氏95度のヒートブロックに5分間置き、RNAを変性させます。その後、すぐに氷の上にチューブを置き、2分以上インキュベートします。
逆転写キットを使用して cDNA を合成します。16マイクロリットルの反応混合物を含むPCRチューブに変性ウイルスRNA溶液を4マイクロリットル加え、気泡を発生させないようにピペットと慎重に混合します。チューブを回転させた後、サーモサイクラーで逆転写を行います。
定量PCRの場合、ロタウイルスのNSP3ゲノムセグメントの963〜1,049領域を標的としたクエンチャー挿入プローブを使用してください。標準プラスミドをPCRグレードの水で連続して希釈し、定量PCRのマスターミックスに進みます。96ウェルPCRプレートのウェルにマスターミックスの20マイクロリットルを加えます。
次に、5マイクロリットルのcDNAサンプルまたは標準プラスミドの5マイクロリットルを10回ピペット処理して混合します。テキストプロトコルの条件に従って定量PCRを実行します。最後に、テキストプロトコルに記載されているようにMA104細胞表面に結合したロタウイルスゲノムを計算する。
ここに示されているのは、ロタウイルスの成長曲線である。修正されたゴンペルツモデルに最小二乗法を適用することにより、特定の成長率は0.197と推定され、ラグ期間は6.61時間と推定されます。初期のtiterに対する静止段階での相対ウイルス・トイターは3.15である。
6つのテストされたロタウイルスクローンのうち、特定の成長率の推定値は0.19から0.27の範囲でした。モデルフィッティングの決定値の係数が0.98を超えるため、これらの推定値は信頼できます。細胞結合アッセイの結果は、結合効率として表示され、これは、接種に存在するものに対する結合ウイルス粒子の比率である。
細胞表面に結合する私達のRVビリオンは細胞結合の試しのための24ウェル版を使用するとき結合効率のおよそ1%のミリリットルあたりの10,000コピーである。培養細胞は物理的ストレスに敏感であるため、緩衝液と寒天を穏やかに、しかし迅速に注ぐように注意してください。基本的に、ウイルスのための新しいシステムが導入されました。
このシステムを用いて、実際の細胞結合能と比成長率を計測器で評価することができます。我々のプロトコルは、形質特性を測定する上で有利である。新たに出現した株の異なるをチェックすることによって、あなたはウイルスのための新しいワクチンを評価するのに役立ちます。
ウイルスはBSL-2病原体として指定されているので、この手順を実行するためにBSL-2実験室を準備する必要があります。
