We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1。セットアップの構築<ol><li>光学解像度のフラットベッドスキャナを選択：4,800 DPIを;ハードウェアの解像度：4800 X 9600 dpiの;カラービット深度：48ビット、該当する温度と湿度レベルで動作することができます。 </li><li>ペトリ皿は、通常は商用のスキャナに使用される紙とは異なり、かなりのボリュームがあります。コロニーは約5mmスキャナ面の上方に、寒天層の上に横たわる。注：ほとんどのスキャナのコロニーが焦点になります。 </li><li>スキャナの企業が同じコンピュータに同じタイプのスキャナの複数のインスタンスの接続を許可していない。複数のスキャナが付属して一意に識別できることを確認します。 </li><li>下記のとおりアクセサリーを準備します。 <ol><li>無菌ブラックの準備枚のプレートをカバーする布（ 図1のステップ2）を感じました。 </li><li>所定の位置にペトリ皿を保持するために、スキャナに合う白い板ホルダ（材料と方法）を調製し、6 HOLを持っているESの皿の大きさ（ 図1のステップ3）。 </li></ol></li><li>微生物の成長に必要な場合には、温度制御された環境でスキャナを置く。コンピュータにスキャナを接続します。 </li><li>オプション：コンピュータにリレーを接続し、温度勾配を克服するために、スキャナのオン/オフスイッチをバイパスします。 注：リレーユニットは非常に温度に敏感な微生物のためである。電子機器が不均一に表面を加熱しないように、それは、スキャナのスイッチを切る。スキャナ面の一部のみを使用すると、同様の結果を得ることができる。 </li></ol> 2。スキャンマネージャをインストール<ol><li> http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.htmlから指定されたディレクトリにすべての「スキャンマネージャ」アプリケーション·ファイルをコピーします。 </li><li>彼らはコンピュータの管理] - &gt; [デバイスマネージャ] - &gt; [イメージングデバイス（に表示されるようにスキャナ名に従ってScanningManager.exe.configファイルを設定<stroNG&gt;図2）。 </li><li> 「スキャンマネージャ」アプリケーションのトラブルシューティングについては、私を読んでファイルを参照してください。 </li><li> 「スキャンマネージャ」アプリケーションの詳細ドキュメントについては、マニュアルライブラリを参照してください。 </li></ol> 3。実験を行う<ol><li>ペトリ皿（ 図1）を準備します。 <ol><li>約2,000 CFU / mlに文化を希釈します。プレート、プレート表面に均一に文化の0.1ミリリットル。 </li><li>コロニーと皿の間に良好なコントラストを得るために、湿気を吸収するために、無菌の黒の部分にプレートをフェルト布をカバーしています。プレートに蓋を置く。 </li></ol></li><li>スキャナのホルダーにプレートを置きます。 </li><li>付属のスキャナのリストから参加するスキャナを選択します。スキャンマネージャ（ 図3）を起動します。 （繰り返し回数）を撮影する画像の数、後続の画像間の時間間隔（時間間隔）、およびtを開始する前に時間遅延を選択する彼は（後に開始）実験。 </li></ol> 4。画像の解析を注：計算方法の概要をhttp://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publicationsにおける非商業的な使用のために自由に利用できる「ScanLag」を使用して、MATLABで画像を解析するために設けられている。 HTML。利用可能な更なる機能は、ソフトウェアの取扱説明書に記載されており、サンプルコードが補充される。 <ol><li>別々のフォルダに各スキャナから画像を並べ替えます。 </li><li> MATLABのコマンドウィンドウを使用して、次の手順を実行します。これらの手順を実行するために必要なパラメータは、ソフトウェアのマニュアルで定義されています。 <ol><li>前処理を実行するためにPreparePicturesを実行します。前処理では、スキャナからの画像が並んでいる。各ペトリ皿は、画像の各シーケンスからトリミングされます。各画像が収集された時刻は、タイムスタンプから取得される。 </li><li> Eで検出および追跡を行うために実行TLAllPlatesACHペトリ皿は、別々に、コロニーが検出され、識別番号が割り当てられる。 </li><li>抽出されたデータの解析：すべての検出されたコロニーの大きさは、時間の関数として測定される。コロニーの出現分布を抽出するために（さらなる情報は、ソフトウェアのマニュアルで提供されています）MATLABのコマンドウィンドウに以下の機能を使用します。 <ol><li>並んでコロニーのグラフで特定のペトリ皿の分析を表示するために実行ScanLagAppは時間（ 図4）対サイズです。 <ol><li>プレートの現在の時刻を変更するには、スライダを使用します。タイミングもコロニー面積グラフ上の整合縦線で示される。 </li><li>それに関連付けられた曲線を表示するには、コロニーをクリックし、その逆も、それに関連付けられた植民地を見つけることが、曲線をクリックしてください。コロニーを識別した後、表現型は、特定されたペトリ皿からコロニーを選択することによって取得することができます。 </li><li>チュウによって自動解析の欠陥をフィルタコロニーを歌うと除外]ボタンをクリックする。コロニーの数を除外クリックすると黄色に変わります。 </li></ol></li><li>各プレートの分析の結果を経て、結果をまとめる。 <ol><li>外観時間のヒストグラムを作成するためにAddHistogramsを実行します。 </li><li>分布の生存曲線の表現を作成するplotDeathCurveを実行します。 </li><li>実験で全てのコロニーの出現時間を取得するためにGetAppearanceTimesを実行します。 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
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M., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+density+detection+times+to+assess+the+effect+of+acetic+acid+on+single-cell+kinetics.">Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).</li><li>Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+measuring+lag+times+in+division+of+individual+bacterial+cells+using+image+analysis.">A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).</li><li>Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes.">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li><li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations.">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li><li>Balaban, N. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells.">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li><li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance.">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li><li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking.">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li><li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence.">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes.">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li><li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis.">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li><li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

直接観測に基づく微視的な方法は、多くの場合、単一細胞の挙動を研究するための「黄金標準」とみなされている。細菌集団における遅延時間の分布の測定を可能ScanLagは、単一細胞分析から得られた分布とよく一致してデータを提供し、非常に高い統計を達成する。 いくつかの重要なステップは、うまく動作するように、この方法のために実行されなければならない：第一に、良好な画像を得るために4800 X 9600でなければなりませんスキャナの解像度、に妥協はありません。第二に、電源管理モジュール（ステップ1.6）なしで、温度勾配がフラットベッド表面に発展と成長に影響を与える可能性があることに注意してください。もう一つの重要なステップでは、誤ってソフトウェアによってコロニーとしてカウントされている可能性が塵埃等の欠陥の濾過である。ソフトウェアの組み込みのバックグラウンド除去は、通常、これらの欠点を克服し、時には「偽」のコロニーがする必要が手動でフィルタリングする。 主なトラブルシューティング手順は、いくつかの理由のためにセットアップにおけるプレート間の変動に対処するかもしれない：（a）の微生物の成長速度は温度によって影響される。異なる温度と湿度の条件は、培養器内の皿の不均一な換気や場所に発生する可能性があります。 （b）は、スキャナの電子機器は、スキャナの表面を横切る温度勾配を加熱し、発生する可能性があります。10を一緒にする前に、スキャナの表面の温度の測定値と、 バチルス属細菌に対するそのような空間的な熱勾配の影響を、 図電源管理モジュールを実施した後（ステップ1.6）。このモジュールは、新しいスキャナに必要でないかもしれないことに注意し、スキャナ面の一部のみが使用される場合、電力管理は不要である。寒天栄養素のさまざまな不透明度（C）プレートは、検出のさまざまなレベルにつながる可能性があります。 図11は、目を示しています異なる不透明になる栄養寒天の異なるボリュームのE許容値。 実験的にS​​canLag技術は、実施が容易であり、唯一の標準ペトリ皿上の微生物をめっきすると、スキャナの表面上に配置する必要があります。開発されたソフトウェアは、全体の手順を制御します。画像取得が自動的に行われ、コロニー追跡のための画像解析は、自動である。さらに、システムはスケールアップすることができると同時に、多くの異なる状態を測定する。最後に、この方法は、商業オフィススキャナに依存し、従って、低コストである。 この技術は、E.異なる微生物の研究に拡張することができる大腸菌 K-12は、しかし、いくつかの考慮がなされなければならない。以前の刊行物7に詳細に記載されるように、まず、後のもの早期出現したコロニーの影響が評価されなければならない。 E.のための大腸菌 K-12、プレート当たりのCFUの最大密度は200です。コロニーの様々なサイズ、そしてコロニー間の他の可能なクロストークと他の株、異なる密度を必要とする場合があります。第二に、プレートの分析は、固体培地とコロニーの間のコントラストに応じて修正する必要があるかもしれません、特定のソフトウェア·ベースのしきい​​値に較正される。ソフトウェアは遅れ、成長速度を越えて、他のコロニーの特徴を抽出することも拡張することができる。ソフトウェアコードは開放され、コロニーの形状、明るさ、平滑性、色を抽出するために修飾することができる。 測定は、単一の細胞に由来するコロニー上で行われるため、データは、集団レベルの測定によって測定することができない新たな表現型を明らかにする。遅延時間分布の重要性は、抗生物質の存在下で明らかにされる。多くの抗生物質のみが増殖している細胞に対して有効であることが知られている;従って限り細胞は誘導期に残り、増殖しないように、それらはプロあるこれらの抗生物質21の影響から保護対象。生き残り細菌の数は、抗生物質による治療15,22,23の間の時間間隔で評価されると、persistersと呼ばれる細菌の亜集団は、しばしば明らかにされる。特定の場合において、抗生物質治療に対する耐性は、長期の遅れに起因する。この設定を使用すると、この遅れは明らかにし、多くの場合、非自明な分布24（ 図6）を有する。また、このメソッドは、まれな変異体の検索を可能にします。例えば、突然変異誘発された集団をメッキした後に、変異体​​は表現型に基づいて同定することができ、選択することなく、直接単離する。セットアップはまた、近くのコロニーの密度の関数としてコロニーの増殖を測定することにより、細胞間相互作用を監視することができるし、そのようなクオラムセンシングや群がって細菌の蔓延などの現象を定量化する。この方法を使用して将来の実験によって発見された多次元情報は、微生物集団のより良い特性評価につながるS·医療·環境研究の進歩。

細菌は多くのストレスの多い状況に対応するために進化してきた。ストレスへの適応の一般的な特徴は、成長のダイナミクス1,2の変化である。指数関数的な成長速度と遅延時間、新しい条件に適応するのに必要な時間、すなわち：成長動態は、2つのパラメータによって主に特徴付けられる。ハイスループット方法の多数の成長速度の測定値に焦点を当てるのに対し、それが新たな条件への適応の特徴付けのための重要なパラメータであるが、遅延時間は、しばしば見落とさパラメータである。変化する状況への適応の定量化は、伝統的に面倒な手動の方法の3,4を用いて行われた。より最近では、高度な技術は、単一セル5,6の分析のために開発されてきた。しかしながら、成長の遅い成長遅延から（即ち遅延時間） の2,3次の正常な成長を区別することは困難である。自動化された方法はに、ScanLag 7、構築したこれら2類似の表現型を区別。 遅延時間の分布の研究の重要性の顕著な例は、抗生物質治療の下で明らかにされる。多くの抗生物質および他のストレスは、活発に増殖する細胞を殺す、及び、従って、「遅れ」された細胞を8保護されている。遅れ時間を監視するためには、顕微鏡下で単一細胞を観察し、1分割までの時間を監視することができます。この方法の主な欠点は、ダイナミック時間範囲が制限されることである。早く成長している細胞を効果的により長い遅延時間を有する細胞の増殖を低下させる、指数関数的に表面を覆う。フローチャンバーの使用は幾分この5を回避するが、限られた数の細胞を追跡することができ、人口の大部分が成長し始めた後に遅滞期を終了した細菌の割合を観察することができない。これらの制限にもかかわらず、いくつかの研究は、ジのレベルの影響を評価したfferentは単一細胞顕微鏡9月12日を使用して、遅延時間の分布に強調している。遅延時間の分布をモニターする別の方法は、濁度測定13,14を介してである。各々が単一の細胞から開始し、多くの並行培養は、経時的な培養中の細菌の数を測定する光学密度プレートリーダーで増殖させる。このメソッドは、外挿の精度によって、プレートのウェルの数に制限されています。 自動化された方法であっても、非常に長い遅延時間を持っている人口の中の細菌の割合が低いため、評価されるように遅延時間および成長時間の分布を可能にする、ScanLag呼ばれ、開発されました。この方法は、従来の栄養寒天プレート15（ 図1）上のコロニーの検出に基づく。検出16,17を定期的にプレートの画像を取得するために家のソフトウェアから指示される商用のスキャナ18の配列を自動化するために、設計されました。ソフトウェアだった画像を自動的に分析し、このような各コロニーの出現時間と80ピクセルに20ピクセルから成長するための時間として定義される各コロニーの成長時間などの定量的なパラメータ19,20を抽出するために設計されています。ここでは、システムのセットアップ、より良いユーザインタフェースを改善されている自動画像解析ソフトウェアの使用を含め、詳細に方法を提示する。 この方法は、形態および色のようなコロニーの他の特性を測定するように構成することができる。パラメータこれらのタイプの測定は、多次元フェノミクスでのシステムの使用が可能になります。この方法は、単一細胞からのコロニーを検出すると、システムは、集団レベルの測定によって測定することができない新たな表現型を明らかにすることができる。技術は稀な亜種の検出および検索を可能にし、所望の形質についてのスクリーニングを容易にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

遅延時間分布抽出の一例として、 図5は、スクリーニングアッセイにおいて行われるであろうように、経時的に一つのプレート上の特定の特性を持つ各コロニーを識別し、追跡するScanLagの能力を示している。 微生物の培養が不均一である場合、異なる亜集団は、アッセイ中に自分自身を明らかに可能性があります。例えば、 図6は、出現定量化を示すので、E.の突然変異株における二峰遅延時間の分布を明らかにする大腸菌。 細胞の増殖速度は、コロニーの出現時間に影響を与える。コロニーを同じ割合で成長すると、後期外観はラグタイム（ 図7）に帰することができる。 この方法は確かに単一セルの遅延時間を測定することを検証するために、我々は、単一細胞顕微鏡を用いて得られたものとScanLag結果を比較し;この検証は、お得です。以前の出版物7で詳しくribed。この方法は、顕微鏡を用いて評価することができるよりも多くの細胞のモニタリングを可能にします。顕微鏡を使用してScanLagを使用して得られたディストリビューションは、大部分が重複している。 ScanLag分布がやや広い。理論的な分析は、分割時間の標準偏差のオーダであることが広がりを予測する。成長時間は各菌株ごとに異なる​​場合には、外観の遅れの原因は、他の方法を用いて検討しなければなりません。 後でコロニーの外観に早期出現したコロニーの影響を調べた。対照実験7は、後述外観限り、プレートあたりのコロニーの総数が（ 図8）200を超えないように影響されなかったことを確認した。別の対照実験は、プレート上のコロニーの位置が、その出現時刻7に影響を与えないことを確認した。 Pの分析lates増殖培地または微生物の種類に存在する栄養素に応じて変更が必要になることがあります特定のしきい値に校正されています。それにもかかわらず、分析は、 図9に示すように、閾値の広い範囲のために非常に堅牢である。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。コロニーの出現分布を作成するために必要な手順の概略図。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。付属のスキャナ、およびコンフィギュレーションファイルの名前を示すデバイスマネージャのスクリーンショット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">拡大表示するには、ここをクリックしてください</a>この図のバージョン。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。スキャンマネージャのスクリーンショット。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。ScanLagAppのスクリーンショット。プレートの画像は、左ペインにあり、マニュアルに詳述されるよう各コロニーの成長曲線は、右側のペインにあります。 2つ以上のコロニーがマージするときコロニー面積曲線のいくつかではスパイクが発生します。コロニーのマージが起きると、これらのコロニーの面積は接合領域であると考えられる。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> 図5つのプレートの分析の代表的結果（A）実験の終了時検出アプリケーションの出力の画像。各コロニー領域は、同定および着色固有のID番号が付与されている。矢印はコロニー（強度閾値に基づいて検出されるB.において測定代表コロニーを指すが、LB寒天またはM9寒天培地上の大腸菌コロニーの場合、この閾値は0.03である。他のメディアまたは細菌の場合、この閾値は、機能ProcessPicturesに調整することができる）。 （このしきい値は、関数MatchColoniesで変更することができる）10以上のピクセルがカウントされているオブジェクトのみ。コロニーの検出は、約10 5の細菌から始まります。このプレートの4つの代表的なコロニーの時間に対するピクセル単位面積（B）をプロットします。コロニーが検出されたときに各コロニーの「出現時間」である。各コロニーの &#39;成長時間は、「あちこちに成長するための時間として定義される（それらの境界は機能getAppearanceGrowthByVecを使用して調整可能です）80ピクセルに20ピクセルをメートル。ソフトウェアは、上限に達する前にマージされたコロニーを除外します。その特性に応じて、特定のコロニーの同定は、識別番号と各コロニーに割り当てられた色に簡単に感謝です。例えば＃1のコロニー、56、77および124は、両方のグラフで強調表示されます。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> 図6外見定量化は、二峰性遅延時間の分布を明らかにすることができる。2つの異なる株のための出現回数ScanLag分析のヒストグラムの比較。青線：野生型株指数関数的に成長している（合計：1,320コロニー）;遅れ細菌（：1,529コロニー数）で強化され、赤のラインの高持続性変異体。 （A）は正規外観ヒストグラム。ピーク指数関数的に増殖する細胞の出現の検出可能なコロニーに成長するのにかかる平均的な時間である。挿入図：二峰遅延時間の分布を示す対数等間隔のビン上の実際の遅延時間を取得するために指数関数的文化のピークの時間を差し引いた後の変異株の同じヒストグラム。 （B）は対数目盛で、（A）と同じデータの生存関数。この表現は、変異株の後期外観テールを強化します。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> 図7外見分布及び成長時間分布（A）及び（B）は、二次元の出現時刻のヒストグラムおよび2つの異なる条件（ソフトウェアが上限に到達する前にマージされたコロニーを除く）の成長時間を示している。 （C）のヒストグラムを比較する成長時間（D）は似ているのに対し、2株の出現時間の差は、表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> 図8は、初期のコロニーの出現は、後にコロニーの出現を妨げない。（A）単独めっき野生型細胞の時間分布遅れる。 （B）許容温度への転送後に、一人で低温感受性株の時間分布ラグ。 （C）は、同じ条件下で一緒にプレーティングし、両株の時間分布遅れる。黒い線は別々に歪みを測定する際に得られたデータに基づいて予想される分布を表す。良いA予想と測定された分布間greementであれプレートあたりのコロニーの総数が200未満であるとして得られる。 <img alt="図9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> 。図9は、検出閾値は、コロニーの外観分布の形状に影響を与えないコロニーの出現分布は二つの異なる閾値の大きさを使用して同じデータセットを分析した。 （A）しきい値サイズは10ピクセルです。 （B）は 、しきい値サイズは50ピクセルです。ヒストグラム当たりの細胞数：約。 1500。異なる検出閾値は、検出時間のずれが生じる。 <img alt="図10" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> 図10。温度安定性測定のACR電源管理なしのスキャナ上に成長させた枯草枯草菌のコロニーを有するプレートのOSSスキャナの表面（A）画像。表面が底に暖かいので、コロニーが速く成長。プレートの横に緩やかなラインは、熱勾配の概略図である。 （B）温度安定性は、スキャナの表面を横切って配置された2つの熱電対で測定した。スキャナは、各走査中に、時間をかけて加熱する。 （C）は、電源管理を使用すると、温度が均一であり、コロニーは同様の速度で成長する。 （D）電源管理モジュールと、（B）と同じ。 ±0.2℃の温度安定性<img alt="図11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> 図11。外観分布の差はディが原因である可能性があり固体培地の量のfferences。同一の細菌培養物は、寒天表面の異なる高さで、その結果、LB寒天の異なるボリュームを有するプレート上にプレーティングした。異なる高さは、プレートの異なる不透明度、したがって異なる検出時間につながった。インタープレート差がチェックされ、異なる高さの条件の違いました。 LB寒天の30±0.5ミリリットルの等容量のプレート間の（A）の代表的な違い。異なる高さの条件との間の（B）の違い：外観分布は30±0.5ミリリットル（緑）の40±0.5ミリリットル（青）で、20±0.5ミリリットル（赤）の容積を有するプレートを測定した。各条件は、6種類のプレートの平均である。限り板の体積が±5ミリリットルの範囲内にあるように、不透明度は同様であり、同様の外観時間分布をもたらす。

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ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag：ハイスループットコロニーの成長の定量化とラグタイム

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.0K ビュー.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

免疫・感染学

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNAウイルスの広域スペクトルの化学抑制剤のためのハイスループットスクリーニング

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

高スループット、リアルタイム、細胞内抗菌活性のデュアル読み出しテストおよび真核細胞の細胞毒性

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...