この方法は、細菌病原体がヒトタンパク質を利用してヒトで病気を引き起こす方法など、宿主と病原体の相互作用分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、任意の病原体が宿主の感染を確立するためにビトロネクチンを利用できる場合に答えることができる。細胞外マトリックスに関与する宿主タンパク質であるビトロネクチンに焦点を当てるが、補体活性化の決定経路において補体阻害剤としても機能する。
これらの事実は、ヒトの病気を引き起こす病原体にとって非常に重要であり、非常に魅力的です。フローサイトメトリーの準備のために、250ナノモルビトロネクチンを含むブロッキングバッファーの50マイクロリットルで細菌ペレットを再懸濁します。次いで、試料を振らず室温で1時間インキュベートする。
インキュベーション後、3,500gで5分間の遠心分離により細菌をペレット化した。次いで、PBSおよび同様の遠心分離工程を用いてペレットを3回洗浄する。洗浄後、PBS BSAで1〜100希釈で細菌ペレットに50マイクロリットルの原生羊抗ヒトビトロネクチンポリクローナル抗体を加える。
懸濁液を室温で1時間インキュベートする。次いで、PBSで細菌を3回洗浄し、非結合抗体を除去する。次に、フルオレセインイソチオシアネート結合ロバ抗羊ポリクローナル抗体をペレットに含むPBS BSAの50マイクロリットルを添加する。
暗闇の中で1時間室温でインキュベートする。最後に、3回の洗浄工程の後、細菌ペレットを300マイクロリットルのPBSで再懸濁し、フローサイトメトリーで分析する。ELISAの準備のために、ポリソープマイクロテイタープレートの各ウェルにタンパク質溶液の100マイクロリットルを分配します。
蓋でプレートを閉じ、マイクロタイタープレートウェルにタンパク質を固定化するために一晩摂氏4度で保管します。シンクの上に逆さまに傾けることによってマイクロティタープレートから溶液を捨てます。その後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSで3回井戸を洗います。
2.5重量%BSAを含むPBSで室温で1時間コーティングされた井戸をブロックします。ブロッキング溶液を取り除いた後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗います。次に、10マイクロリットルの50ナノモル組換えPHを各サンプルに加えます。
コントロールウェルには、PBS BSAの100マイクロリットルのみを追加します。プレートを室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、タンパク質溶液を廃棄し、ウェルあたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗浄することによって結合していないタンパク質を除去する。
次いで、抗ヒスポリクローナル抗体をコンジュゲートした馬根ペルオキシダーゼを含有するPBS BSAの100マイクロリットルを添加する。室温で1時間インキュベートした後、井戸あたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗います。各ウェルに100マイクロリットルのELISA検出試薬を添加して抗原抗体複合体を検出します。
次いで、反応を停止するためにウェルあたり1モル硫酸の50マイクロリットルを加える。マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルでウェルの光学密度を測定します。メーカーのガイドラインに従ってアミンカップリング法を使用して、アミン反応性センサーにヒトビトロネクチンを固定化します。
PBSを使用して、組換えPHリガンドをゼロから4マイクロモルに連続して希釈し、得られた溶液を96ウェルブラックフラットボトムマイクロタイタープレートに移します。バイオ層干渉計装置を使用して、30°Cで実験を実行します。ピペット10マイクログラムの1ミリリットル/2マイクログラムのPBSで、ガラス顕微鏡スライド上に1滴としてスライドする。
スライドの下に、室温で30分間乾燥させます。タンパク質コーティングされたガラススライドをPBSを含むビーカーに2秒間浸して3回洗浄し、過剰なコーティングされていないタンパク質を除去します。次に、新鮮なヒフ文化の10ミリリットルを無菌プラスチックペトリ皿に加え、コーティングされたガラススライドを培養液に沈めます。
20 RPMで振って1時間摂氏37度で調理します。インキュベーション後、テキストプロトコルに記載されているようにグラム染色によって結合細菌を可視化する前にPBSで満たされたビーカーにスライドを3回浸すことによって、任意の結合されていない細菌を除去する。テキストプロトコルに記載されているように培養A549上皮細胞。
1回の洗浄と細胞のトリプシン化を摂氏37度で行った後、1ミリリットル当たり5マイクログラムのゲンタマイシンを含む完全な培地を用いて、細胞懸濁液を1ミリリットル当たり5,000細胞に希釈する。細菌感染の前に、ウェル内の培地をF12培地に交換し、摂氏37度で一晩インキュベートする。細胞単層を室温で1ミリリットルのPBSで3回洗浄します。
次に、氷の上にプレートを置き、ビトロネクチンの1ミリリットル当たり10マイクログラムを含む予冷F12培地の200マイクロリットルを置きます。プレートを摂氏4度で1時間インキュベートした後、ピペット処理して溶液を捨て、室温で1ミリリットルのPBSで細胞層を2回洗浄します。各井戸にF12培地で成長したばかりのヒフ野生タイプの100マイクロリットルを追加します。
プレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。次いで、培地をピペットで吸引し、PbsでA549上皮細胞を3回洗浄する。細胞剥離液の井戸あたり50マイクロリットルを加え、摂氏37度で5分間のインキュベーションに従ってください。
次に、F12完全培地を50マイクロリットルの完全な培地に加えて酵素反応を停止します。上皮細胞を各ウェルから4個のガラスビーズを含む6ミリリットルのガラスチューブに移します。室温で細胞を2分間渦を起分させる。
細胞ライセートを100倍に希釈した後、10マイクロリットルの希釈したサンプルをチョコレート寒天板にプレートする。摂氏37度で一晩のインキュベーションに続いてコロニーを数えます。ヒト血清の殺菌活性に対するビトロネクチン依存性の解析を行うために、第一の培養およびペレットの細菌をテキストプロトコルに記載した。
遠心分離後、デキストロースゼラチン-ベロナルバッファーの1つの体積で細菌ペレットを再懸濁します。次に、1,500 CFUの細菌をDGVBプラス5%血清を含む100マイクロリットルに加えます。300 RPMで振って15分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。
反応混合物から10マイクロリットルのアリコートをゼロ分および15分で取り出す。チョコレート寒天にアリコートを置き、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。チョコレート寒天プレートのインキュベーション後、プレートに現れるコロニーを数え、テキストプロトコルに記載されているように殺された細菌の割合を計算する。
この研究で試験されたすべてのHif臨床分離株は、フローサイトメトリーによって決定されるように細胞表面にビトロネクチンを募集した。野生型ヒフ株によるビトロネクチンの結合は集団のシフトを引き起こしたのに対し、変異体はビトロネクチンを結合しなかった。主要なビトロネクチン結合タンパク質PHとビトロネクチンとのタンパク質相互作用は、ELISAによって推定された。
結果は、PHとビトロネクチンの両方と陰性対照に対する陽性対照との間の有意な相互作用を示す。PHとビトロネクチンの相互作用は、バイオ層干渉法を用いてリアルタイムで2.2マイクロモルの親和性を有すると推定された。さらに、細胞表面上のPHの発現不足の細菌は、野生型細胞と比較してビトロネクチン被覆ガラス表面への付着性を低下させた。
さらに、上皮細胞の表面にビトロネクチンが存在すると、Hifの付着が著しく高まりました。ビトロネクチンの補体阻害活性を推定するために、血清媒介性殺死を検討した。野生型Hif細胞は変異細胞よりも高い血清抵抗性を示した。
熱不活化血清の存在下で細菌は殺されなかった。興味深いことに、野生型ヒフはビトロネクチン枯渇血清中の生存率の低下を示し、ビトロネクチンの補充は細菌生存率を増加させた。しかし、変異株はビトロネクチンを細胞表面にリクルートできなかったため、ビトロネクチンの枯渇に反応しなかった。
一度習得, この技術は、任意の病原体のために3〜4日で行うことができますし、細菌病原体の新鮮な培養を使用することを忘れないでください.このビデオを見た後, 病原体に結合ビトロネクチンを分析する方法についてよく理解している必要があります。.この技術に加えて、ビトロネクチン結合表面タンパク質の細菌は、プロテオミクスおよびウェスタンブロッティングを用いて同定することができる。
この技術は、宿主と病原体の相互作用の分野の研究者にとって重要であり、また細菌の病原性のメカニズムを探求する。
